[發明專利]OsPT2磷高效利用轉基因大豆培育方法

有效

• 申請號: 201410232281.3
• 申請日: 2014-05-28
• 公開（公告）號: CN104004755A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 朱月林;蓋鈞鎰;陳國戶;楊立飛
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/29;C12N15/82;C12N15/84;C12N1/21;C12Q1/68;A01H5/00
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤

1.一種磷轉運蛋白OsPT2基因表達盒，其特征在于：該表達盒序列如SEQ?ID?NO.2所示。

2.權利要求1所述的磷轉運蛋白OsPT2基因表達盒的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)設計引物，擴增序列為SEQ?ID?NO.1所示的OsPT2基因片段；其中，上游引物P1：如SEQ?ID?NO.3所示；下游引物P2:如SEQ?ID?NO.4所示；

2)將OsPT2基因連接到pMD19-T質粒載體，轉化TOP10感受態細胞，提取陽性重組質粒，進行SacI和XbaI雙酶切，回收OsPT2基因片段；

3)進行植物表達載體pBI121SacI和XbaI雙酶切，回收pBI121大片段；

4)以連接酶連接上述回收的OsPT2基因片段和pBI121大片段，形成連接產物，以連接產物轉化TOP10感受態細胞，37℃過夜培養，挑取單克隆擴大培養，篩選出轉化子；

5)提取步驟4)中轉化子的陽性重組質粒進行EcoRI及HindIII雙酶切，回收小片段，即得到OsPT2基因表達盒；

其中，步驟2)、3)和步驟5)中雙酶切體系為：50μL體系中10×Buffer15μL，BSA0.5μL，DNA15μL，SacI1.0μL，XbaI1.0μL，ddH₂O補至50μL；37℃反應2h；雙酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的片段；

步驟4)中連接反應體系為：10×T₄ligase?Buffer2.5μL，pBI121大片段2μL，OsPT2基因片段8μL，T₄DNA連接酶1μL，ddH₂O補至25μL。

3.OsPT2基因在磷高效利用轉基因植物中的應用，優選地，在磷高效利用轉基因大豆中的應用。

4.一種磷高效利用轉基因大豆的培育方法，其特征在于將水稻磷轉運蛋白基因OsPT2構建至植物表達載體pCAMBIA3301中，獲得重組植物表達載體pCAMBIA3301-OsPT2中，通過農桿菌介導的方法導入大豆；具體包括如下步驟：

1)重組植物表達載體pCAMBIA3301-OsPT2的構建：將水稻磷轉運蛋白OsPT2基因表達盒構建至植物表達載體pCAMBIA3301中，形成重組植物表達載體pCAMBIA3301-OsPT2；

2)OsPT2轉基因大豆轉化體的獲得：以大豆子葉節為外植體，通過農桿菌介導法，將植物表達載體pCAMBIA3301-OsPT2導入大豆基因組中，通過除草劑Bialaphos篩選獲得T₀代轉化體；

3)OsPT2轉基因大豆T₂代陽性植株的獲得：T₀代植株通過自花授粉獲得T₁代種子，T₁代種子萌發后通過PCR及GUS染色鑒定出陽性植株，陽性植株自花授粉獲得T₂代種子；T₂代種子萌發后通過同樣的方法鑒定出陽性植株，獲得磷高效利用轉基因大豆。

5.一種重組植物表達載體pCAMBIA3301-OsPT2，其特征在于含有權利要求1所述的磷轉運蛋白OsPT2基因表達盒和除草劑抗性基因bar基因，水稻磷轉運蛋白OsPT2基因表達盒位于到植物表達載體pCAMBIA3301的EcoRI及HindIII酶切位點之間。

6.權利要求5所述的植物表達載體pCAMBIA3301-OsPT2，在磷高效利用轉基因植物培育中的應用，優選地，在磷高效利用轉基因大豆培育中的應用。

7.一種宿主菌，其特征在于含有權利要求4所述的重組植物表達載體pCAMBIA3301-OsPT2。

8.權利要求7所述的宿主菌在磷高效利用轉基因植物培育中的應用，優選地，在磷高效利用轉基因大豆培育中的應用。