[發明專利]一種殼聚糖酶及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201410230852.X
• 申請日: 2014-05-28
• 公開（公告）號: CN104004732A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 周站平;趙雙枝;蘇理;宋江寧;王壽權;馬延和
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N5/10;C12P19/14;C12P19/04;C12P19/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及生物技術領域中一種殼聚糖酶及其制備方法和應用。

背景技術

殼聚糖是葡萄糖胺以β-1，4糖苷鍵連接形成的直鏈聚合物，是幾丁質脫乙酰基的衍生物。高聚合度的殼聚糖溶于酸性溶劑，被廣泛地應用于食品、制藥、紡織、污水處理等行業。低聚合度的殼聚糖稱為殼寡糖，水溶性大于99％，比殼聚糖具有更優越的生物活性。殼寡糖可以抑制細菌和真菌的生長，提高機體的免疫活性和抗癌能力，還可作為植物調節劑，增強植物對病蟲害的防御能力等。近年來針對殼寡糖生產和利用的研究越來越受到重視。

殼聚糖酶(EC.3.2.1.132)是一類可以將殼聚糖降解的酶，作用于殼聚糖的β-1，4糖苷鍵。相比于傳統的化學水解殼聚糖法，酶解法的反應條件溫和、殼寡糖得率高、對環境的污染小，具有較好的發展前景。

不同來源的殼聚糖酶的酶解產物也千差萬別。而最近的研究表明：殼聚五糖、殼聚六糖和殼聚七糖具有很好的抗腫瘤活性。目前報道的殼聚糖酶的酶解產物多為殼聚二糖和殼聚三糖。

殼聚糖酶廣泛地存在于多種生物中，在細菌、真菌、病毒以及植物中均發現了殼聚糖酶。目前國內對于殼聚糖酶的研究大多集中在野生產酶菌株的篩選以及發酵條件的優化等方面，但野生菌的產酶能力遠遠不能達到工業應用的需求。因此構建生產工藝簡單、產量高的工程菌是提高殼聚糖酶工業化水平的關鍵。

發明內容

本發明的目的是提供一種蛋白質及其編碼基因與相關生物材料。該蛋白質具有較高的殼聚糖酶活性，能將殼聚糖降解為下述五種殼寡糖中的全部或部分：殼聚三糖、殼聚四糖、殼聚五糖、殼聚六糖和殼聚七糖。

本發明所提供的蛋白質，名稱為ChiTS，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白質：

a)氨基酸序列是SEQ?ID?No.2的蛋白質；

b)氨基酸序列是SEQ?ID?No.4的蛋白質；

c)將SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有殼聚糖酶活性的蛋白質；

d)將SEQ?ID?No.4所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有殼聚糖酶活性的蛋白質。

其中，SEQ?ID?No.2由408個氨基酸殘基組成，是天然殼聚糖酶ChiTS(名稱為NChiTS)的氨基酸序列；SEQ?ID?No.4由416個氨基酸殘基組成，是重組殼聚糖酶ChiTS(名稱為RChiTS)的氨基酸序列；SEQ?ID?No.4第1-408位氨基酸序列為SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列。

上述c)或d)中的蛋白質可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述c)中的蛋白質的編碼基因可通過將SEQ?ID?No.1所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變。上述d)中的蛋白質的編碼基因可通過將SEQ?ID?No.5所示的第3-1253位核苷酸序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變。

與ChiTS相關的生物材料也屬于本發明的保護范圍。

本發明所提供的與ChiTS相關的生物材料，為下述B1)至B16)中的任一種：

B1)編碼ChiTS的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表達盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重組載體；

B4)含有B2)所述表達盒的重組載體；

B5)含有B1)所述核酸分子的重組微生物；

B6)含有B2)所述表達盒的重組微生物；

B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物；

B8)含有B4)所述重組載體的重組微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的轉基因動物細胞系；

B10)含有B2)所述表達盒的轉基因動物細胞系；

B11)含有B3)所述重組載體的轉基因動物細胞系；

B12)含有B4)所述重組載體的轉基因動物細胞系；

B13)含有B1)所述核酸分子的轉基因植物細胞系；

B14)含有B2)所述表達盒的轉基因植物細胞系；

B15)含有B3)所述重組載體的轉基因植物細胞系；

B16)含有B4)所述重組載體的轉基因植物細胞系。