[發明專利]StNHX1基因表達盒、應用及耐鹽轉基因大豆培育法

在審

• 申請號: 201410229771.8
• 申請日: 2014-05-27
• 公開（公告）號: CN103981179A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 朱月林;蓋鈞鎰;陳國戶;楊立飛
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/29;C12N15/82;C12N15/84;C12N1/21;C12Q1/68;A01H5/00
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤

1.一種Na⁺/H⁺逆向轉運蛋白StNHX1基因表達盒，其特征在于：該表達盒序列如SEQ?ID?NO.2所示。

2.權利要求1所述的逆向轉運蛋白StNHX1基因表達盒的構建方法，其特征在于包括如下步驟：

1)設計引物，擴增序列為SEQ?ID?NO.1所示的StNHX1基因片段；其中，上游引物P1:如SEQ?ID?NO.3所示；下游引物P2:如SEQ?ID?NO.4所示；

2)將StNHX1基因連接到pMD19-T質粒載體，轉化TOP10感受態細胞，提取陽性重組質粒，進行BamHI和SacI雙酶切，回收StNHX1基因片段；

3)進行植物表達載體pBI121BamHI和SacI雙酶切，回收pBI121大片段；

4)以連接酶連接上述回收的StNHX1基因片段和pBI121大片段，形成連接產物，以連接產物轉化TOP10感受態細胞，37℃過夜培養，挑取單克隆擴大培養，篩選轉化子；

5)提取步驟4)中轉化子的重組陽性質粒進行EcoRI及HindIII雙酶切，回收小片段，即得到StNHX1基因表達盒；

其中，步驟2)、3)和步驟5)中雙酶切體系為：50μL反應體系，10×Buffer1?5μL，BSA0.5μL，DNA15μL，BamHI1.0μL，SacI1.0μL，ddH₂O補至50μL；37℃反應2h，雙酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析進行回收；

步驟4)中連接反應體系為：10×T₄ligase?Buffer2.5μL，pBI121大片段2μL，StNHX1基因片段8μL，T₄DNA連接酶1μL，ddH₂O補至25μL。

3.StNHX1基因在耐鹽轉基因植物培育中的應用，優選地，在耐鹽轉基因大豆培育中的應用。

4.一種耐鹽轉基因大豆的培育方法，其特征在于將野生茄子Na⁺/H⁺逆向轉運蛋白基因StNHX1構建至植物表達載體pCAMBIA3301中，獲得重組植物表達載體pCAMBIA3301-StNHX1，通過農桿菌介導的方法將重組表達載體導入大豆；具體包括如下步驟：

1)重組植物表達載體pCAMBIA3301-StNHX1的構建

將野生茄子StNHX1基因表達盒構建至植物表達載體pCAMBIA3301中，形成重組植物表達載體pCAMBIA3301-StNHX1；

2)StNHX1轉基因大豆轉化體的獲得

農桿菌介導大豆子葉節方法，將重組植物表達載體pCAMBIA3301-StNHX1導入大豆基因組中，通過除草劑Bialaphos篩選獲得T₀代轉化體；

3)StNHX1轉基因大豆T₃代陽性植株的獲得

T₀代植株通過自花授粉獲得T₁代種子，T₁代種子萌發后通過PCR及GUS染色鑒定出陽性植株，陽性植株自花授粉獲得T₂代種子；T₂代陽性植株自花授粉獲得T₃代種子；T₃代種子萌發后通過同樣的方法鑒定出陽性植株。

5.一種重組植物表達載體pCAMBIA3301-StNHX1，其特征在于含有權利要求1所述的Na⁺/H⁺逆向轉運蛋白基因StNHX1表達盒和除草劑抗性基因bar基因，Na⁺/H⁺逆向轉運蛋白StNHX1基因表達盒位于載體pCAMBIA3301的EcoR?I和HindIII位點之間。

6.權利要求5所述的重組植物表達載體pCAMBIA3301-StNHX1，在耐鹽轉基因大豆培育中的應用。

7.一種宿主菌，其特征在于含有權利要求5所述的重組植物表達載體pCAMBIA3301-StNHX1。

8.權利要求7所述的宿主菌在耐鹽轉基因植物培育中的應用，優選地，在耐鹽轉基因大豆培育中的應用。