[發明專利]一種用于檢測隱蔽態T-2毒素的免疫磁珠間接競爭ELISA試劑盒的制備及應用

有效

• 申請號: 201410229447.6
• 申請日: 2014-05-23
• 公開（公告）號: CN103983771A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 王雅玲;吳朝金;孫力軍;邱妹;徐德峰;劉穎
• 申請（專利權）人: 廣東海洋大學
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/531
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務所有限公司 44228
• 代理人: 劉廣生

1.一種用于檢測隱蔽態T-2毒素的免疫磁珠間接競爭ELISA試劑盒，其特征在于：所述檢測試劑盒包含有洗滌液、樣品稀釋液、顯色液、終止液，還包括：

（1）包被抗原的免疫磁珠：以3-Ac-NEOS-HS-OVA為包被抗原，經PB緩沖液將包被抗原稀釋到200?μg/mL，在含有0.4?mg經EDC和NHS活化的羧基磁珠的離心管中加入1?mL包被抗原，重懸后，在37?℃下，偶聯反應3?h后，洗滌液洗滌2-4次，磁力架上進行磁分離去除洗液后，再向離心管中加入封閉液0.5?mL，重懸37?℃下反應1-2?h，洗滌液洗滌2-4次制得；

（2）檢測抗體：可識別隱蔽態T-2毒素的抗T-2毒素母核多克隆抗體；

（3）酶標抗體：辣根過氧化物酶標記的羊抗兔酶標抗體；

????（4）標準T-2毒素母核工作液：以T-2毒素作為標準母核供體，配制不同濃度的標準母核工作液。

2.根據權利要求1所述的一種用于檢測隱蔽態T-2毒素的免疫磁珠間接競爭ELISA試劑盒，其特征在于：所述封閉液為含5%卵清蛋白或者5%脫脂奶粉的PB緩沖液。

3.根據權利要求1所述的一種用于檢測隱蔽態T-2毒素的免疫磁珠間接競爭ELISA試劑盒，其特征在于：所述抗T-2毒素母核多克隆抗體的制備方法為：免疫原3-Ac-NEOS-HS-BSA與弗氏完全佐劑進行1：1混合乳化完全，選擇2.0-2.5?kg之間的大白兔進行免疫；后每間隔兩周進行一次加強免疫，免疫原3-Ac-NEOS-HS-BSA與弗氏不完全佐劑進行1：1混合乳化完全，并于每次加強免疫后的第10天進行一次耳緣靜脈采血，檢測抗血清效價，當效價達到要求后，進行心臟采血，并進行抗血清純化制備，得抗T-2毒素母核的多克隆抗體。

4.根據權利要求2所述的一種用于檢測隱蔽態T-2毒素的免疫磁珠間接競爭ELISA試劑盒，其特征在于：所述PB緩沖液的制備方法為：先配制0.2?mol/L的Na₂HPO₄和0.2?mol/L?NaH₂PO₄，取19?mL?0.2?mol/L的Na₂HPO₄和81?mL?0.2?mol/L?NaH₂PO₄，充分混合即為0.2?mol/L?PB緩沖液，pH為7.4-7.5。

5.一種用于檢測隱蔽態T-2毒素的免疫磁珠間接競爭ELISA試劑盒的制備方法，其特征在于：以包被T-2毒素母核抗原的免疫磁珠為載體，隱蔽態T-2毒素與免疫磁珠競爭抗T-2毒素母核多克隆抗體，通過酶聯免疫反應，間接檢測樣品中隱蔽態T-2毒素的含量；

具體方法為：

（1）利用純化的T-2毒素母核免疫原3-Ac-NEOS-HS-BSA免疫新西蘭種兔子，制備得高效價可識別隱蔽態T-2毒素的抗血清，硫酸銨沉淀法純化抗血清得抗T-2毒素母核多克隆抗體；

（2）T-2毒素母核包被原免疫磁珠的制備：37?℃環境下，活化后磁珠與T-2毒素母核包被原3-Ac-NEOS-HS-OVA偶聯旋轉孵育3?h；用洗滌緩沖液洗滌免疫磁珠反復三次，每次間隔3分鐘，用封阻緩沖液于37?℃旋轉孵育2小時，置于保存緩沖液中4?℃保存待用；

（3）按照有機溶劑提取法處理樣品，處理后樣品與免疫磁珠混合重懸于含10%甲醇的PBS緩沖液中；加入T-2毒素母核抗體37?℃下旋轉孵育2.5?h，加入250?μL的稀釋度為1：3000的酶標抗體，37?℃旋轉孵育2?h，磁分離，PBST洗滌三次；加入250?μL的TMB，室溫反應15?min后，加入100?μL?2?mol/L的H₂SO₄，終止反應；磁分離，上清液至96孔酶標板中，450nm下檢測OD值，根據標準曲線計算隱蔽態T-2毒素濃度。