[發(fā)明專利]加壓素、加壓素鞣酸鹽的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410229108.8
• 申請日: 2014-05-27
• 公開（公告）號: CN103980351A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 洪勇;江錫銘;丁金國;黃臻輝
• 申請（專利權(quán)）人: 上海第一生化藥業(yè)有限公司
• 主分類號: C07K7/16
• 分類號: C07K7/16;C07K7/14;C07K7/06;C07K1/20
• 代理公司: 上海弼興律師事務(wù)所 31283
• 代理人: 朱水平;王衛(wèi)彬

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及加壓素、加壓素鞣酸鹽的制備方法。

背景技術(shù)

血管緊張素(或血管緊張素胺)為增血壓藥，英文名angiotensinamide或[Asn¹，Val⁵]-angiotensinⅡ，化學(xué)結(jié)構(gòu)為L-Asn-L-Arg-L-Val-L-Tyr-L-Val-L-His-L-Pro-L-Phe，是由八個(gè)氨基酸殘基組成的合成多肽，理論分子量1031.18。血管緊張素用于外傷或手術(shù)后休克和全身麻醉或腰椎麻醉時(shí)所致的低血壓癥等，可預(yù)防或治療圍手術(shù)期低血壓，作為急救用藥治療休克期低血壓，也可用于治療血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑用藥過量且常規(guī)治療無效時(shí)。

鞣酸加壓素，是由九個(gè)氨基酸殘基組成的合成多肽，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為L-Cys-L-Tyr-L-Phe-L-Gln-L-Asn-L-Cys-L-Pro-L-Arg-L-Gly(1→6)-二硫鍵鞣酸鹽，加壓素的理論分子量1084.24。鞣酸加壓素為抗利尿激素藥，能促進(jìn)遠(yuǎn)端腎小管及集合管對水分的重吸收而具有抗利尿作用，其制劑臨床用于治療尿崩癥。

醋酸奧曲肽(Octreotide?acetate)，是由七個(gè)氨基酸殘基和一個(gè)蘇氨醇組成的合成多肽，化學(xué)結(jié)構(gòu)為D-苯丙氨酰-L-半胱氨酰-L-苯丙氨酰-D-色氨酰-L-賴氨酰-L-蘇氨酰-N-[2R-羥基-1R-(羥甲基)丙基]-L-半胱氨酰胺環(huán)(2→7)-二硫鍵醋酸鹽，奧曲肽的理論分子量為1019.26，其原料藥凍干粉中醋酸含量為5％～12％。醋酸奧曲肽可抑制生長激素，抑制胃腸胰臟分泌多肽等，其制劑臨床用于需要長期奧曲肽治療的活動(dòng)性肢端肥大癥，如術(shù)后生長激素殘留致血清生長激素水平增高，垂體外照射放射治療后尚未達(dá)到充分療效的血清生長激素水平升高，部分不適合手術(shù)治療及新診斷生長激素分泌腺瘤患者的術(shù)前治療。

目前已上市多肽藥物常見的純化方法大都采用了制備型高效液相色譜法，該法是獲得高純度多肽目標(biāo)分子的最有效的方法，也是我們固相合成血管緊張素純化和脫鹽的主要技術(shù)手段。一般多肽藥物純化制備工藝設(shè)計(jì)是先中低壓色譜富集目標(biāo)多肽，然后高壓色譜精制，但是考慮到我們目標(biāo)多肽血管緊張素分子量約1kD，無合適的分子篩凝膠柱(其上樣量小，流速低，處理量小，比較適合分子量大于10kD蛋白的脫鹽)或超濾膜選擇。而且中低壓色譜中常用的分離方法有分子篩色譜法、離子交換色譜法和疏水相互作用色譜法，這些色譜方法中用到的填料的粒徑通常從幾十微米到幾百微米不等，空隙尺寸多為幾百納米不等，無法得到高純度的目標(biāo)多肽。如果采用高鹽洗脫，后期處理無法找到合適的脫鹽方案，分離純化效果也有限，樣品損失很大，回收率計(jì)算也較復(fù)雜，對于后期反相制備很不利。現(xiàn)在還缺乏一種有效的制備多肽鹽原料藥的方法，因此仍然迫切需要開發(fā)新的多肽鹽的純化工藝。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于為了克服現(xiàn)有技術(shù)中多肽鹽的制備工藝復(fù)雜、收率低的缺陷，而提供了一種多肽、多肽鹽的制備方法。本發(fā)明的多肽鹽的制備方法以多肽為起始原料，經(jīng)過高壓反相色譜純化和脫鹽步驟，制備高純度的多肽鹽、特別是血管緊張素醋酸鹽、鞣酸加壓素和醋酸奧曲肽的方法。

發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)的研究發(fā)現(xiàn)，目前高壓反相色譜法經(jīng)典純化的填料是硅膠基質(zhì)，其柱效好，分辨率高，但色譜條件pH2-7耐受較窄；而安捷倫聚合物填料PLRP-S為苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物，可耐受較寬闊的pH范圍(pH范圍可達(dá)1-14)，并且可用1M?NaOH溶液再生，也可以精準(zhǔn)控制孔徑大小與孔徑形態(tài)，使得溶質(zhì)分子無障礙擴(kuò)散，相對于硅膠基質(zhì)，其增加了有效表面積，能保持很好的柱效和分辨率，且提升了填料的載樣量。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題的：

本發(fā)明提供了一種多肽的制備方法，其包括下述步驟：采用高效液相反相色譜法將多肽粗品溶液依次進(jìn)行反相純化、反相脫鹽，即可；高效液相反相色譜法的填料為苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物。

其中，所述的多肽粗品可為本領(lǐng)域的各種多肽粗品，較佳地為堿性多肽粗品，更佳地為血管緊張素粗品、加壓素粗品或奧曲肽粗品。所述的血管緊張素粗品較佳地為專利申請CN201210131066.5公開的采用固相法合成的血管緊張素粗品，HPLC純度為80～90％；所述的加壓素粗品較佳地為專利申請CN201210131067.X公開的采用固相法合成的加壓素粗品，HPLC純度為80～90％；所述的奧曲肽粗品較佳地為采用固相法合成制得的奧曲肽粗品，HPLC純度為80～90％。