[發明專利]負載蛋白、多肽類藥物微球立體形態及分布的測定方法

有效

• 申請號: 201410228503.4
• 申請日: 2014-05-27
• 公開（公告）號: CN104020182A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 張永明;羅宇燕;黎吶;郭喆霏;鐘晨
• 申請（專利權）人: 中山大學附屬第三醫院
• 主分類號: G01N23/04
• 分類號: G01N23/04;G01N15/08;G01N15/02
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 李海恬

技術領域

本發明涉及一種微球測定方法，特別是涉及一種負載蛋白、多肽類藥物微球立體形態及分布的測定方法。

背景技術

近年來，蛋白質多肽類藥物在診斷、治療艾滋病、癌癥、肝炎、糖尿病等疾病，或疫苗預防疾病等方面發揮著重要的作用。但由于蛋白質多肽類藥物的體內外穩定性差，注射給藥后，藥物很快失活，為達到療效往往需要頻繁、大劑量給藥，導致毒副作用及耐受性的產生，嚴重限制了其在臨床上的應用。

而用聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)、聚乳酸(PLA)等生物可降解聚合物，將生物大分子藥物包被成緩釋肌注微球(microsphere)，可提高藥物的生物利用度，實現藥物控釋或緩釋，具有提高藥效、降低毒副作用、提高病人順應性與耐受性的優點。

微球在研發的過程中，局限于以載藥量、包封率、粒徑等作為評價指標，再采用體內外釋放結果來指導和調整制備工藝因素，并且進行體內外釋放行為的考察后才能驗證處方的優劣，往往出現前期篩選各項指標良好，但后期釋藥行為不理想的現象。因此，缺乏關于微球制備工藝、處方因素、微球理化性質及釋藥性能之間廣泛深入的理論支持，導致了負載蛋白、多肽類藥物的PLGA微球科研效率低、周期長，成功率低。

許多研究表明微球結構的改變會影響藥物的釋放，如在復乳化溶劑揮發法的基礎上，加入致孔劑可使制得微球內部結構疏松，突釋現象明顯，釋放增快。此類研究包括在內水相加入滲透劑，發泡劑；或在有機相加入油酯，成球后溶劑洗滌除去。而在連續相(即外水相)中加入滲透劑，得到的微球內部結構致密，藥物不易突釋，相應緩釋時間延長。其采用不同方法的目的是使微球表面的多孔結構愈合，阻礙原本經孔道釋放的藥物，降低藥物突釋?？傊缥⑶蚪Y構變得疏松，則藥物突釋增加、釋放增快；如微球結構變得致密，則突釋減少，緩釋周期延長。另外，改變微球的制備方法可以使蛋白分布更為均勻，能夠成功避免微球的藥物突釋。且大量研究表明微球的結構和微球的降解、藥物的釋放之間關系極為密切。因此，研究微球骨架及藥物在空間上的三維分布，對藥物釋放數學模型建立及發展，建立高效的篩選平臺，縮短微球研發周期，提高研發效率有極為重大的意義及研究前景。

而常規的表征微球空隙結構的方法具有一定局限性，難以分析微球內部的結構參數。如：水銀或氣體孔隙度測定法，氮氣脫附吸附法用于測定微球內部孔隙的分布，但無法測量密閉的孔隙，且過高的壓力可能會破壞微球的原有的結構；而掃描電子顯微鏡(SEM)可用于定性分析微球結構，其分辨率較高，但僅能觀察到微球表面，無法對微球的內部整體結構進行分析；另有共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)和傅里葉變換紅外光譜可用于定性或半定量觀察微球內的藥物分布，但分辨率較低，不能滿足定量分析微球內藥物分布的詳細信息。

Nano-CT(Nano?computed?tomography，納米計算機斷層掃描技術)，屬于無損檢測的技術范疇。Nano-CT主要由X射線成像系統和計算機系統兩部分組成。Nano-CT掃描時，由X射線成像系統中的微焦點X光機產生X射線并垂直透過被測試物體，衰減后的X射線被探測器所采集，通過模數轉換，在監視器上顯示掃描后所獲得的圖像；由計算機系統對掃描得到的圖像進行重建，生成高密度分辨率的橫截面圖像。具有高空間和時間分辨率(可達納米級)、高穿透性、豐富的襯度機制、友好的成像環境以及線性吸收等特點。在微電子產業、生命科學、能源和環境科學、材料科學等各種領域有著非常廣闊的應用。

發明內容

基于此，本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種負載蛋白、多肽類藥物微球立體形態及分布的測定方法，采用該方法，能夠得到微球的立體形態空間分布等立體結構信息。

為實現上述目的，本發明采取以下技術方案：

一種負載蛋白、多肽類藥物微球立體形態及分布的測定方法，包括以下步驟：

1)樣品準備

將微球置于容器中，加入固定液，靜置，使固定液完全滲透微球；棄去固定液，以磷酸鹽緩沖液清洗微球，棄去磷酸鹽緩沖液；加入乙醇清洗，脫去微球中的水；然后加入含染色劑的乙醇溶液，靜置，確保染色劑完全浸透微球，并與微球中負載的蛋白、多肽類藥物結合，再以磷酸鹽緩沖液將未與蛋白、多肽類藥物結合的染色劑清洗去除，得到待測微球樣品；

2)Nano-CT斷層掃描

將待測微球樣品置于Nano-CT斷層掃描設備中，調節光子能量為5-12keV，采用大視場模式掃描，設置單幅曝光時間為15-25秒，并以0.2°-0.8°的步長在-90°-+90°的角度內采集微球二維投影圖像；

3)數據分割