[發明專利]黃瓜離體葉綠體電轉化方法

無效

• 申請號: 201410227461.2
• 申請日: 2014-05-27
• 公開（公告）號: CN103966255A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 白艷玲;劉盛海;路瑤;王宏剛;徐海津;王勇;張秀明;喬明強
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N5/10;C12Q1/68
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

【技術領域】：

本發明屬于植物基因工程技術領域，涉及以黃瓜為代表的高等植物離體葉綠體電轉化、孵育及檢測等方法。

【背景技術】：

葉綠體是母系遺傳的植物特有細胞器，在細胞中不僅具有相對獨立的環境，而且拷貝數很高，葉綠體遺傳轉化可實現外源基因的定點整合、以原核方式進行基因表達、利于同時轉化多個基因和外源基因可穩定遺傳等優點，是目前克服核轉基因引發的基因逃逸、生態環境污染和食品安全恐慌等科學瓶頸問題的一種重要途徑。

在高等植物細胞中有多拷貝，通常使用基因槍才能將外源表達載體打入細胞內的部分葉綠體中，若獲得細胞內所有葉綠體共同轉化狀態，還需要在篩選壓力逐漸淘汰未轉化的葉綠體，經過多世代過程最終達到葉綠體同質化。由于葉綠體轉化存在技術難、周期長、耗材與儀器昂貴的問題，極大地限制了這項極具前途技術的研究與應用速度。

電轉化雖然是一種普遍用于單細胞原核生物和真核生物核基因組轉化的常用方法，但高等植物離體葉綠體電轉化還沒有查閱到可借鑒的成熟技術及文獻。

【發明內容】：

本發明目的是解決現有組織和細胞水平葉綠體轉化操作難、周期長和成功率低的問題，以黃瓜(Cucumis sativum)為材料，提供一種在無菌條件下的黃瓜離體葉綠體電轉化、孵育與轉化效果鑒定的成套操作方法與試劑配制體系。

本發明涉及完整葉綠體分離與轉化前后處理、適宜條件與檢測方法的一系列操作實現轉化。離體葉綠體轉化最大的優勢是效率高和時間短，可以通過轉化后瞬時轉錄物分析進行多種相關研究。此方法可普遍用于其他高等植物。

本發明提供的黃瓜(Cucumis sativum)離體葉綠體電轉化、孵育和轉化效果鑒定方法具體步驟包括：

第1、黃瓜離體葉綠體電轉化與孵育：

第1.1、4℃和無菌條件下，將新鮮提取的黃瓜葉綠體進行離心(1000g/8～10min)，用0.3M～0.33M山梨醇溶液重懸葉綠體沉淀后再次離心，重復這樣的洗滌3～4次。

第1.2、最后用0.3M～0.33M山梨醇溶液重懸葉綠體，并控制葉綠體懸液濃度為5～6×10⁶/mL，冰浴。

第1.3、取150ul葉綠體溶液至1.5ml離心管中，加入約1ug轉化質粒(葉綠體表達載體)，混勻后轉入預冷的電轉化杯中，以13kV/cm電壓電擊；電擊后迅速向電轉化杯中加入葉綠體孵育液，輕輕混勻后轉移到1.5ml離心管中，以150rpm/min和25℃下避光孵育20分鐘左右，轉4℃避光過夜。

第2、黃瓜離體葉綠體電轉化后PCR鑒定：

第2.1、4℃下以1000g/8～10min離心收集經電轉化和孵育的葉綠體，用1ml葉綠體孵育液重懸葉綠體，然后再離心，重復2次這樣的洗滌；

第2.2、取84ul孵育液重懸葉綠體，加入6ul DNaseI和10ul Buffer，25℃消化2h；加入0.5M EDTA4ul至終濃度為20mM，65℃水浴20min，終止DNase I反應；

第2.3、4℃下1000g/8～10min離心收集葉綠體，用0.33M山梨醇洗葉綠體沉淀2～3次，取部分上清作為模板進行PCR，檢測葉綠體外是否殘留轉化質粒；

第2.4、向葉綠體沉淀中加入400ul裂解液，65℃水浴20min；加入200ul5M KAc(pH7.0)，冰浴25～30min；4℃下12000rpm離心，取上清并加入200ul Tris-酚和200ul氯仿/異戊醇(24:1)，振蕩后12000rpm離心，取上清；加入1/10V3M NaAc和2.5V無水乙醇，-20℃冰箱過夜沉淀核酸；次日12000rpm離心15min，棄上清。70％乙醇洗沉淀2次，37℃溫箱烘干后用含RNase的ddH₂O溶解葉綠體DNA沉淀。

第2.5、以提取的葉綠體DNA為模板，依據第1步中葉綠體表達載體上的外源基因序列設計引物，以20μL總體系和35個循環進行PCR。

第3、黃瓜離體葉綠體電轉化后RT-PCR鑒定：

第3.1、在4℃下，以1000g/8～10min離心收集經電轉化和孵育的葉綠體，用1ml葉綠體孵育液重懸葉綠體，然后再離心，重復2次這樣的洗滌；取150ul孵育液重懸葉綠體，加入等體積葉綠體裂解液混合均勻，65℃處理5min；加入2M的KCl40μl，混合均勻后置于冰上10-20min；