[發(fā)明專利]一種雙向電泳蛋白質(zhì)樣品的定量方法

在審

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• 申請日: 2014-05-27
• 公開（公告）號: CN104020145A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉云;曹嵩;李曉飛;朱欣婷;胡姍姍;卜雯雯;鄧文文;劉仕福
• 申請（專利權(quán)）人: 遵義醫(yī)學(xué)院
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 貴陽東圣專利商標(biāo)事務(wù)有限公司 52002
• 代理人: 袁慶云

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種蛋白質(zhì)的定量方法。?

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背景技術(shù)

蛋白質(zhì)定量是細(xì)胞分子生物學(xué)實驗中的重要環(huán)節(jié)。常用的蛋白定量方法有二喹啉甲酸法（BCA法）以及Bradford?MM于1976年發(fā)明的考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法），兩者都是基于吸光度值的定量方法。雙向電泳（2-D）是蛋白質(zhì)組學(xué)研究過程中的核心技術(shù)，由于2-D蛋白樣品處理工藝復(fù)雜，所用試劑種類繁多。此過程中所使用的尿素、硫脲、曲拉通?X-100(Triton?X-100)、十二烷基硫酸鈉（SDS）等試劑易與BCA、考馬斯亮藍(lán)（CBB）反應(yīng)顯色，從而影響吸光度值進(jìn)而影響定量準(zhǔn)確性，因此這兩種方法都不能用于2-D實驗。鑒于以上試劑兼容性問題的存在，伯樂公司（Bio-Rad）公司和通用電氣公司（GE）各自研發(fā)出專門針對2-D的蛋白質(zhì)定量試劑盒，但這些試劑盒都是基于分光光度法開發(fā)的，操作步驟較多，對實驗者操作要求較高，且試劑盒價格不菲。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服上述缺點而提供的一種操作簡單，準(zhǔn)確、快速且廉價的雙向電泳蛋白質(zhì)樣品的定量方法。?

本發(fā)明的一種雙向電泳蛋白質(zhì)樣品的定量方法，包括如下步驟：?

（1）雙向電泳蛋白樣品制備：取不同來源的生物樣品10-100mg，加1-5mL雙向電泳細(xì)胞裂解液，重懸后收集于離心管冰上超聲，每次超聲10s，暫停10s，共計5個循環(huán)；4℃、14000g離心30min，將上清轉(zhuǎn)移至新離心管，分裝后-80℃保存，得雙向電泳蛋白樣品；

（2）用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的制備：用雙向電泳細(xì)胞裂解液配制1-2mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）溶液，取8支離心管，分別加入0-200μL牛血清白蛋白溶液，并用超純水補足至1mL，使標(biāo)準(zhǔn)蛋白的終濃度為0-0.2mg.mL^-1，然后每支離心管中加入0.01%考馬斯亮藍(lán)G-250或R-250染液5mL，充分混勻，得不同濃度標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，待測；

（3）雙向電泳蛋白樣品混合溶液制備：取10-100μL雙向電泳蛋白樣品加入離心管中，用超純水補足至1mL，再加入0.01%?考馬斯亮藍(lán)G-250或R-250染液5mL，充分混勻，待測；

（4）加樣：取孔板一塊，在各孔中分別加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)混合溶液和雙向電泳蛋白樣品混合溶液200-1000μL；

（5）掃描并框選熒光強度：加樣完成后迅速將孔板去蓋后用基因公司LI-COR的Odyssey近紅外熒光成像系統(tǒng)，在680nm通道下掃描成像，并框選熒光區(qū)域；

（6）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：記錄各孔的熒光強度，以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合溶液為橫坐標(biāo)（X），對應(yīng)的熒光強度為縱坐標(biāo)（Y），擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程；

（7）計算雙向電泳蛋白樣品的濃度：將雙向電泳蛋白樣品混合溶液孔的熒光強度代入回歸方程，即可計算出待雙向電泳蛋白樣品的終濃度。在終濃度基礎(chǔ)上乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即是雙向電泳蛋白樣品原液的濃度。

上述的一種雙向電泳蛋白質(zhì)樣品的定量方法，其中：步驟（1）中雙向電泳細(xì)胞裂解液中含有：7-9mol/L尿素、0-2mol/L硫脲、質(zhì)量濃度4%的3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽、65mmol/L二硫蘇糖醇。?

上述的一種雙向電泳蛋白質(zhì)樣品的定量方法，其中：步驟（4）中孔板的規(guī)格為24、48或96孔。?

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有明顯的有益效果，由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明基于考馬斯亮藍(lán)染色聯(lián)合紅外熒光成像法的蛋白質(zhì)定量方法，以牛血清白蛋白（BSA）作為蛋白質(zhì)定量的標(biāo)準(zhǔn)品，不同濃度的BSA和考馬斯亮藍(lán)G-250（或R-250）混合形成蛋白-考馬斯亮藍(lán)結(jié)合物。使用近紅外熒光掃描成系統(tǒng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線用于雙向電泳蛋白質(zhì)樣品的定量。經(jīng)實驗證明，在680nm所在波長下，在0.01mg/mL-0.2mg/mL的范圍內(nèi)，蛋白量與熒光強度表現(xiàn)出良好的線性和可重復(fù)性。本發(fā)明使蛋白質(zhì)定量不受試劑兼容性的束縛，適用與包括2-D實驗和一些試劑兼容性較差的蛋白樣品。能使2-D蛋白質(zhì)定量不再依賴于昂貴且操作繁瑣的專用蛋白定量試劑盒。本發(fā)明還能用于一些試劑兼容性較差的蛋白樣品的濃度的測定。?

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具體實施方式

以下通過實施例和實驗例來進(jìn)一步說明本發(fā)明方法的有益效果。?

實施例1：

一種能用于雙向電泳技術(shù)的蛋白質(zhì)的定量方法，以人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞雙向電泳蛋白樣品為例，包括以下步驟：