[發明專利]產石杉堿甲的激素自養型蛇足石杉離體葉狀體克隆系

無效

• 申請號: 201410225801.8
• 申請日: 2014-05-27
• 公開（公告）號: CN103975857A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 涂藝聲;徐賢柱;楊萍;蔡險峰;陳曼;吉枝單
• 申請（專利權）人: 江西師范大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及創造藥物成分石杉堿甲的植物性資源及其生物技術，尤其涉及一種產石杉堿甲的激素自養型蛇足石杉離體葉狀體克隆系。

背景技術

蛇足石杉Huperzia?serrata?(Thunb．ex?Murray)?Trev．，又名千層塔、蛇足石松、蛇足草等，為石杉科石杉屬蕨類植物，全草入藥。自1972年國內首次報道該植物中的生物堿-?石杉堿甲(?hupenine?A,?Hup-A)具有橫紋肌松馳作用，以后深入研究發現該生物堿是一種強效、可逆和高選擇性乙酰膽堿酯酶抑制劑。在低劑量Hup-A下對乙酰膽堿酯酶(Ach?E)有強大的抑制作用，使分布區內神經突觸間隙的乙酰膽堿(Ach)含量明顯升高，從而增強神經元興奮傳導，強化學習與記憶腦區的興奮作用，起到提高認知功能、增強記憶保持和促進記憶再現的作用。石杉堿甲Hup-A是目前國內最為成功的治療阿爾茨海默病(老年性癡呆癥)的藥物。石杉堿甲Hup-A?成分主要來源于天然蛇足石杉全草，由于石杉堿甲的特殊療效,?國內外學者對它的全合成、衍生物及類似物的合成作了大量的工作,亦因Hup-A特殊的分子結構，人工合成費時費力，代價高，至今幾乎沒有得到與天然Hup-A活性相同的衍生物和類似物，因此人工合成的Hup-A及其類似物離商品化生產還有較長距離，隨著老年化社會到來，阿爾茨海默病(老年性癡呆癥)已成為人類的第四大病魔，直接導致國際市場上Hup-A的供應缺口越來越大，自然千層塔資源匱乏凸顯。

由于蛇足石杉等石杉科植物生長于深山密林，生境條件特殊，很難解決石杉科植物大面積的人工栽培。采取石杉科植物離體組織培養可能解決石杉屬植物源Hup-A資源。但植物組織培養中,一般都要加入外源植物生長物質，培養物才能增殖生長，而外源植物生長物質在培養物中的殘存則影響應用。因此，大規模工廠化生產石杉堿甲時，產石杉堿甲的激素自養型蛇足石杉離體葉狀體克隆系是生產開發應用所期望的資源，同時因不需添加外源植物生長物質還具有降低生產成本的優勢。

發明內容

本發明的目的在于提供一種產石杉堿甲的激素自養型蛇足石杉離體葉狀體克隆系，解決了利用蛇足石杉離體培養物提取的石杉堿甲中外源生長物質殘害問題。

本發明是這樣實現的，其方法步驟為：

（1.1）材料

廬山野生蛇足石杉（Huperzia?serrata?(Thunb．ex?Murray)?Trev．）當年抽生新枝；

（1.2）外植體取材與無菌材料的制得

選擇健壯無病蟲害野生蛇足石杉植株，取當年抽生約3㎝長的新枝，用自來水洗去枝葉上的灰塵后，再用洗衣粉液浸泡6～10?min，然后用軟毛筆刷洗枝葉，自來水細流水中漂洗干凈，濾紙吸干水滴后裝入無菌容器中進行表面滅菌處理；轉至超凈工作臺上，再以質量分數75%的乙醇消毒0.5?min?~1?min?，無菌水洗凈，吸干水后，先以質量分數4.5%H₂O₂消毒5~9?min，再用質量分數0.1%～0.5%HgCl₂加0.05ml吐溫80浸泡消毒材料6～10?min，傾去藥液后，用無菌水沖洗6~8?次，然后在無菌條件下，將蛇足石杉新枝分割切成長度為0.5～1cm?左右的莖小段；

（1.3）接種到準備好的葉狀體分化啟動培養基上培養

外植體接種在葉狀體分化啟動培養基上培養至切口處出現綠色小凸點，繼續在葉狀體分化啟動培養基上培養10～15天，綠色小凸點發育成可辨的葉狀體組織，此時的葉狀體組織迅速增殖；葉狀體分化啟動培養基：1/2(6,7–V)?+?NAA?0.1～1.0?mg/L，蔗糖用量20～30g/L；

（1.4）將誘導增殖的葉狀體組織分割成小塊，轉接到葉狀體繼代增殖培養基上定向培養，葉狀體繼代增殖培養基：1/4?MS或1/2MS中添加20~30g/L蔗糖，培養基的pH值5.8～6.0，并在118～120℃高溫高壓下滅菌25min；提供培養環境：恒溫(23±2)℃,相對濕度60%～70%，光照強度為1000～1500lx?,日照時長12～14?h（小時）/d（天）；

（1.5）產石杉堿甲的激素自養型蛇足石杉離體葉狀體克隆系的繼代；一小部分葉狀體切割作繼代小塊，接種到繼代增殖培養基上繼代培養，以后每40～50天轉代一次，建成葉狀體無性繁殖系；另一大部分葉狀體作收獲提取石杉堿甲。

步驟（1.5）的培養條件如下：