[發明專利]一種去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體的制備方法及應用

無效

• 申請號: 201410225274.0
• 申請日: 2014-05-26
• 公開（公告）號: CN103990180A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發明（設計）人: 張智勇;裴國獻;鄒繼偉
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: A61L27/36
• 分類號: A61L27/36;A61L27/38
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 蔡和平

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體的制備方法及應用。

背景技術

目前種子細胞的使用主要以自體細胞為主，但其可獲取量太少，遠遠不能滿足臨床使用所需，因此需要在體外進行擴增，待達到所需數目后進一步完成組織工程骨的構建。在種子細胞的體外擴增方面，今年來以微載體在動態懸浮培養條件下的培養效果較為優越且得到廣泛認可。

但是，目前使用較為廣泛的、可作為同類產品考量標準品的微載體選擇主要為Cytodex系列產品，其中以Cytodex3應用較為廣泛，該產品為人工合成的含變性蛋白表面包被的右旋糖酐顆粒，具有良好的細胞粘附性及均質性；其細胞培養效率高，可在短時間內大量擴增種子細胞用于疫苗、輔酶等的批量生產，或大量擴增干細胞等種子細胞并經消化分離后收集以用于組織工程構建。但是，Cytodex類產品均為人工合成材料，多為不可降解材料，無法直接用于體內組織修復過程，導致經微載體培養擴增的種子細胞不能直接以微載體為體內移植載體而植入體內。大量實驗結果表明，額外的細胞消化分離過程會破壞胞外基質，從而造成細胞活性的喪失及細胞數目的浪費。在解決上述問題的過程中，研究者們試圖通過改良細胞獲取手段、優化微載體材料及制備等方法來提高細胞利用率及有效率，但大都因為細胞活性降低或體內局部酸累積無明顯改善而終止，導致可直接用于體內移植的微載體材料尚較為缺乏。

為了得到質地統一、可控性好的微載體顆粒(微載體的基本要求之一)，在微載體制備過程中多采用人工合成材料及方法來進行微載體加工，這將勢必造成微載體材料在體內的降解性差或不可降解，因而不能作為體內植入材料來應用于種子細胞的體內移植載體，導致種子細胞在經微載體培養擴增后仍需進行消化分離以進行其與移植支架材料的再貼壁過程。總而言之，在現行的微載體制備思路下，采用人工合成材料制備的微載體顆粒將很難作為種子細胞的移植載體，由其培養擴增所得的種子細胞將不可避免的進行再消化分離。

發明內容

本發明的目的在于提供一種去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體的制備方法及應用，制備出可用于體外動態懸浮培養條件并大量擴增種子細胞的微載體。

為實現上述目的，本發明采用如下的技術方案：

一種去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體在制備組織工程材料方面的應用。

所述組織工程材料為修復腔隙狀組織缺損區的組織工程材料。

所述組織工程材料為修復大段骨缺損的組織工程材料。

一種去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體的制備方法，將牛皮質骨進行冷凍粉碎后，篩出粒徑小于200um的骨顆粒，并對骨顆粒進行脫脂、脫鈣和脫蛋白處理，得到去蛋白脫鈣骨基質植入型微載體。

所述冷凍粉碎前將牛皮質骨在-80℃保存24h以上。

所述脫脂具體過程為：向脫脂液中加入骨顆粒并持續攪拌2-3h后用蒸餾水沖洗骨顆粒，然后把沖洗后的骨顆粒加入到脫脂液中，持續攪拌2-3h，其中每3mL脫脂液中加入0.8-1.2g骨顆粒，脫脂液為甲醇與氯仿體積比為1:1的混合物。

所述脫鈣具體為：將骨顆粒加入到0.5-0.6mol/L的鹽酸中，持續攪拌8-12h，然后將骨顆粒取出，然后重復上述過程2-3次；其中，每3mL鹽酸中加入骨顆粒的質量為0.8-1.2g。

所述脫蛋白處理具體為：室溫下，將脫鈣處理后的骨顆粒，依次置于2-3mol/L的CaCl₂溶液攪拌16-24h，0.5mol/L的EDTA溶液中攪拌4h，8mol/L的LiCl溶液中攪拌16-24h，然后在52℃的水浴下加熱4-6h，再用6mol/L脲素溶液抽提36-48h，水洗后收集顆粒，并經過凍干處理；其中，所用2mol/L的CaCl₂溶液、0.5mol/L的EDTA溶液、8mol/L的LiCl溶液、6mol/L脲素溶液的體積為脫鈣處理后的骨顆粒質量的2-3倍。