[發明專利]一種抗仔豬多種腹瀉的復合IgY的制備方法

無效

• 申請號: 201410221645.8
• 申請日: 2014-05-26
• 公開（公告）號: CN104001171A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 敬曉棋;黃光東;張瓊;陳生葉
• 申請（專利權）人: 黃光東
• 主分類號: A61K39/42
• 分類號: A61K39/42;A61P31/14;A61P31/04;A61K39/40
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種抗仔豬多種腹瀉的復合IgY，其特征在于，該抗仔豬腹瀉IgY的配方組成及各個配方所占比例為：按照1∶5的比例用無菌生理鹽水將卵黃粉稀釋，卵黃粉的純度大于95％稀釋。

2.如權利要求1所述的抗仔豬腹瀉IgY，其特征在于，該抗仔豬腹瀉IgY的使用方法為：仔豬出生后，立即口服1.0mL，3小時后仔豬吃初乳。

3.一種抗仔豬多種腹瀉的復合IgY的制備方法，其特征在于，該抗仔豬腹瀉IgY的制備方法包括以下步驟：

步驟一，病原的分離、純化培養及鑒定：

(1)豬流行性腹瀉病毒PEDV和豬輪狀病毒的分離純化培養：

取發病仔豬的空腸和腸系膜淋巴結置于乳缽內，剪碎，反復研磨，加入pH值為7.0的PBS制成1∶5的組織勻漿，-70℃反復凍融3次；5000轉/分鐘離心20分鐘，取上清液經0.22μm的微孔濾膜過濾，然后加入雙抗100IU/mL，-70℃保存，備用；

將處理病料接種于長成單層的vero細胞，每個樣品接種3瓶，設陰性對照，37℃吸附1小時；傾去病毒液，加入含5％血清的M199繼續培養，觀察4d，不出現病變者繼續盲傳5代；有細胞病變者繼續傳代，直到細胞病變穩定；

將出現80％細胞病變者連同培養基一起于-70℃反復凍融3次；5000轉/分鐘離心20分鐘，取上清液經0.22μm的微孔濾膜過濾，然后加入雙抗100IU/mL，用于制作PEDV或豬輪狀病毒免疫原；用于制作免疫原；

(2)大腸桿菌K88的純化培養：購買大腸桿菌K88標準菌株，普通營養肉湯培養基進行擴增培養后，用PBS洗滌3次，作為抗原，用于制作大腸桿菌K88的免疫原；

步驟二，PEDV、豬輪狀病毒、大腸桿菌K88分別與弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑按照1∶1的比例，振蕩器充分震蕩混勻，即為免疫原；

步驟三，免疫8周齡的產蛋雞，雞胸部肌肉分點注射免疫原完全佐劑1mL，10天后用不完全佐劑免疫原進行第二次免疫，第二次免疫10天后用不完全佐劑免疫原進行第三次免疫；

步驟四，第三次免疫之后，15天收集蛋雞所產雞蛋，分離蛋黃；

步驟五，蛋黃加入硫酸葡聚糖，終濃度3.5％，充分攪拌，5000轉/分鐘離心30分鐘，取上清；

步驟六，上清物加30％乙醇，充分攪拌，離心處理后所得沉淀即為抗仔豬腹瀉IgY。