[發明專利]一種多靶點的靶向藥物對黑色素瘤細胞影響的檢測方法

在審

• 申請號: 201410218579.9
• 申請日: 2014-05-22
• 公開（公告）號: CN105092801A
• 公開（公告）日: 2015-11-25
• 發明（設計）人: 陸群英;吳原;戴利成
• 申請（專利權）人: 湖州市中心醫院
• 主分類號: G01N33/15
• 分類號: G01N33/15
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明涉及醫藥檢測方法技術領域，尤其涉及一種檢測多靶點的靶向藥物對黑色素瘤細胞生存及轉移能力影響的檢測方法。

背景技術

黑色素瘤是源于皮膚、粘膜、眼和中樞神經系統色素沉著區域的黑素細胞的惡性腫瘤，是死亡率最高的皮膚癌。據估計，2009年全美黑色素瘤患病68720例，約占皮膚癌患病的92.1％，死亡8650例，占皮膚癌死因的74.6％，且每年患病率在急速上升。黑色素瘤的發病原因目前尚不清楚，治療方案以手術和放射治療為主，輔以藥物治療，但中晚期患者治愈率很低。原因是中晚期腫瘤容易發生轉移。腫瘤轉移是惡性腫瘤最重要的特征之一，也是影響患者預后的主要因素，臨床上90％的腫瘤病人是由于腫瘤轉移而死亡。

腫瘤轉移是指腫瘤細胞從原發部位擴散侵入血管或淋巴管或體腔，部分細胞被血流、淋巴流帶到另一部位或器官，在該處繁殖生長，形成與原發瘤同樣類型的腫瘤。腫瘤轉移是一個復雜的多步驟過程，是腫瘤細胞和宿主細胞雙方共同作用的結果：一方面，腫瘤細胞自身的特性(細胞膜表面的黏附能力，轉移能力，細胞所釋放的某些酶和抗原性物質)決定它能否完成轉移的各個步驟；另一方面，宿主的內環境或免疫防御機制決定腫瘤的轉移是否成功。

可喜的是，由拜耳和ONYX公司共同研制的一種多靶點的生物靶向藥物索拉非尼(sorafenib，多吉美)，被臨床前研究和臨床實驗證實具有廣泛的抗腫瘤作用。該藥物最早被用于腎細胞癌的研究，后經多項臨床和體外實驗發現索拉非尼在其他諸如肺癌、肝癌等腫瘤的治療中也能起到相當好的療效。索拉非尼是一種多激酶抑制劑，能同時抑制多種存在于細胞內和表面的激酶，如RAF、VEGFR2、VEGF3、PDGFR-B、KIT和FLT3等。索拉非尼既可以通過抑制RAF/MEK/ERK信號傳導通路，直接抑制腫瘤生長，又可通過抑制VEGFR和PDGFR而阻斷腫瘤新生血管的形成從而間接抑制腫瘤細胞的生長和轉移。

索拉非尼在其它腫瘤中的研究已得到深入開展，但是，在索拉非尼治療黑色素瘤方面尚存在爭議。研究顯示在60％的黑色素瘤患者組織中存在BRaf基因的突變，而索拉非尼可以抑制細胞RAF/MEK/ERK信號傳導通路，因此推測索拉非尼有可能會改善晚期黑色素瘤患者的預后。而在Eisen等[18]對37例不能手術切除和已有遠處轉移的黑色素瘤患者Ⅱ期臨床試驗研究發現，索拉非尼單藥治療黑色素瘤療效甚微。

目前，靶向治療已經成為最熱門的腫瘤治療研究領域之一，而腫瘤的發生發展是有多種基因和多種激酶共同參與的結果，因此，單靶點抑制劑遠不能滿足腫瘤的治療。而索拉非尼具有獨特的多靶點的抗腫瘤作用，是基于對腫瘤發生的分子生物學機理認識的基礎上研制成功的新藥。其作用主要為抑制腫瘤細胞的生長和血管形成，而非細胞毒效應，因此毒副反應較輕且耐受性較好，優于化療藥物。不僅如此，索拉非尼還具有潛在廣譜的抗腫瘤作用，臨床試驗研究結果已證實索拉非尼對多種腫瘤治療都有明顯療效，這為腫瘤的生物靶向治療翻開了新的篇章。

發明內容

為了研究檢測多靶點的靶向藥物對黑色素瘤細胞生存及轉移能力影響，本發明提出了一種新的檢測多靶點的靶向藥物對黑色素瘤細胞生存及轉移能力影響的檢測方法。

本發明提出的一種檢測多靶點的靶向藥物對黑色素瘤細胞生存及轉移能力影響的檢測方法，其檢測過程分為以下步驟：

1、對黑色素瘤細胞分別常規化療藥物或多靶點的靶向藥物的處理，并設置無處理對照組，觀察各組細胞的細胞增值抑制率，細胞周期和凋亡率，考察多靶點的靶向藥物對細胞生存能力的影響。

2、對黑色素瘤細胞施以步驟1處理后，RT-PCR檢測細胞轉移相關基因PERK的表達情況，在基因水平考察多靶點的靶向藥物對腫瘤轉移的影響。

3、對黑色素瘤細胞施以步驟1處理后，westernblot(蛋白質印跡)技術檢測細胞轉移相關蛋白PERK的表達情況，從蛋白質水平研究，多靶點的靶向藥物對腫瘤轉移的影響。

4、對黑色素瘤細胞施以步驟1處理后，transwell實驗(細胞侵襲實驗)觀察各組細胞的侵襲和轉移能力。

5、綜合數據分析多靶點的靶向藥物對黑色素瘤細胞的生存能力和轉移能力的作用。

優選的：所述黑色素瘤細胞為A375。

優選的：所述多靶點的靶向藥物為由拜耳和ONYX公司共同研制的一種多靶點的生物靶向藥物索拉非尼(sorafenib，多吉美)。

具體實施方式

下面，通過具體實施例對本發明的技術方案進行詳細說明。

1、藥物處理對黑色素瘤細胞A375細胞增殖抑制率、細胞周期和凋亡率的影響