[發(fā)明專利]具提升酶產(chǎn)量及活性之甘露聚糖酶

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410216886.3
• 申請(qǐng)日: 2014-05-21
• 公開（公告）號(hào): CN105087521B
• 公開（公告）日: 2018-02-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭瑞庭;黃建文;鄭雅珊;吳姿慧;賴惠琳;林正言;黃婷沅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東莞泛亞太生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/42
• 分類號(hào): C12N9/42;C12N15/56;C12R1/685;C12R1/84
• 代理公司: 隆天知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司72003
• 代理人: 王芝艷,吳小瑛

技術(shù)領(lǐng)域

本申請(qǐng)系關(guān)于一種甘露聚糖酶，尤指一種具提升酶產(chǎn)量及活性之甘露聚糖酶。

背景技術(shù)

植物細(xì)胞壁主要由纖維素(cellulose)、半纖維素(hemicellulose)及木質(zhì)素(lignin)三種物質(zhì)所組成，其中以纖維素含量最多，半纖維素次之。甘露聚糖為半纖維素中的一個(gè)重要成份，甘露聚糖主要可分成四類:直鏈甘露聚糖(linear mannan)、葡萄甘露聚糖(glucomannan)、半乳甘露聚糖(galactomannan)和半乳葡萄甘露聚糖(galactoglucomannan)。這些多糖體主要是由甘露糖(mannose)為基本單位，以β-1,4-糖苷鍵(glycosidic bond)鍵結(jié)成骨架。內(nèi)切性甘露聚糖酶(endo-β-mannanase)為分解自然界中大量存在的聚甘露醣的主要酵素之一，這類酵素能對(duì)β-1,4-糖苷鍵(glycosidic bond)進(jìn)行隨機(jī)水解作用。此甘露聚糖酶常見于許多細(xì)菌以及真菌之中。

近年來，隨著自然界半纖維素資源的開發(fā)，甘露聚糖酶的工業(yè)利用價(jià)值也漸受重視，并且被廣泛地應(yīng)用于不同工業(yè)上，如：造紙工業(yè)、食品及飼料工業(yè)等。在紙漿及造紙業(yè)中，甘露聚糖酶可用來破壞半纖維素與木質(zhì)素之鍵結(jié)，有利于木質(zhì)素的去除，大幅降低漂白劑及氯的用量。在食品應(yīng)用上，可以當(dāng)作果汁飲料的澄清劑及降低咖啡豆加工時(shí)的黏度，減少蒸發(fā)濃縮的成本。而在動(dòng)物飼料工業(yè)上可當(dāng)做飼料添加劑，提高動(dòng)物對(duì)飼料的轉(zhuǎn)換率。然而針對(duì)不同工業(yè)的應(yīng)用，甘露聚糖酶也需有符合其不同的適用條件與范圍，例如:高耐熱性、高活性及耐酸堿性等，如此在工業(yè)應(yīng)用上才有其商業(yè)價(jià)值及競(jìng)爭(zhēng)性。因此，找出符合不同工業(yè)上所需的酶蛋白也是目前學(xué)術(shù)及產(chǎn)業(yè)界持續(xù)努力的目標(biāo)。

為了得到更符合需求的酶蛋白，目前大致上可分為兩個(gè)方向去進(jìn)行：其一是從自然界中篩選合適的酶基因，例如目前已從嗜堿菌Bacillus sp.N16-5中分離出耐堿的甘露聚糖酶，其最適pH值為pH10.0；而具耐酸性的酶，則由嗜酸菌Aspergillus sulphureus分離出來。另一個(gè)途徑就是將現(xiàn)有已產(chǎn)業(yè)化的酶蛋白再加以進(jìn)行基因改造，以符合不同產(chǎn)業(yè)的需求。

而現(xiàn)今改造酶蛋白主要有兩大策略：其一是隨機(jī)突變(random mutagenesis)或是將酶基因隨機(jī)排列，再在特定的作用條件之下，篩選出更符合其作用條件的酶蛋白。舉例來說，有學(xué)者將Armillariella tabescens的MAN47基因采取隨機(jī)突變的易錯(cuò)聚合酶連鎖反應(yīng)(error-prone PCR)技術(shù)，將基因序列隨意突變之后，送入Saccharomyces cerevisiae系統(tǒng)表現(xiàn)。在篩選了100多株突變株后，得到比野生株更具耐酸堿性及耐高溫的甘露聚糖酶。此策略的好處是無須深入研究酶的結(jié)構(gòu)或作用機(jī)制，而是直接在特定的條件下隨機(jī)去找出更好的酶蛋白。然而，缺點(diǎn)即是需要大量的人力以及時(shí)間去進(jìn)行大量的篩選，并且此方法也需要有很好的大量篩選方法來配合。

另一種改造策略則是藉由研究酶的三維結(jié)構(gòu)與作用機(jī)制，找出對(duì)于酶活性或特性具有關(guān)鍵性的氨基酸，并針對(duì)這些特定氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變與測(cè)試，進(jìn)而得到功能性更強(qiáng)的改造酶蛋白。舉例來說，Cartmell等人解出外切性甘露聚糖酶(exo-mannanase)CjMan26C蛋白立體結(jié)構(gòu)后，發(fā)現(xiàn)其與內(nèi)切性甘露聚糖酶CjMan26A在結(jié)構(gòu)上有很高的相似度。經(jīng)由結(jié)構(gòu)相互比對(duì)分析后，發(fā)現(xiàn)CjMan26C有四個(gè)氨基酸在空間上的位置與CjMan26A有明顯的不同，而此四個(gè)氨基酸皆位于靠近活性區(qū)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(loop)里。在經(jīng)由突變了CjMan26C這四個(gè)氨基酸后，成功的將CjMan26C活性反應(yīng)模式由外切性甘露聚糖酶轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)切性甘露聚糖酶。由此可知，分析蛋白立體結(jié)構(gòu)可提供許多有助于改造特性的信息，讓研發(fā)人員可以只針對(duì)這些特定氨基酸來進(jìn)行改造，減少大量人力篩選的時(shí)間，來得到適合不同工業(yè)產(chǎn)業(yè)應(yīng)用的甘露聚糖酶。

因此，本申請(qǐng)欲藉由研究甘露聚糖酶的三維結(jié)構(gòu)，對(duì)一些特定的氨基酸進(jìn)行基因突變，進(jìn)而有效提升甘露聚糖酶在工業(yè)上應(yīng)用的產(chǎn)業(yè)價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容

本申請(qǐng)之目的在于改造現(xiàn)有甘露聚糖酶，利用結(jié)構(gòu)分析及定點(diǎn)突變技術(shù)，有效提升甘露聚糖酶之產(chǎn)量及活性，藉以增加甘露聚糖酶之工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。