[發(fā)明專利]一種高產菊粉內切酶的雙啟動子多拷貝重組畢赤酵母菌株

無效

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• 申請日: 2014-05-21
• 公開（公告）號: CN103981112A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發(fā)明（設計）人: 林建強;林勝強;白楊;林建群
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12P19/04;C12R1/84
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

技術領域

本發(fā)明屬于基因工程和發(fā)酵工程領域，涉及一種高水平表達菊粉內切酶單一酶組分的雙啟動子多拷貝重組畢赤酵母菌株及構建方法與應用。?

背景技術

菊粉是由β粉2，1-糖苷鍵連接的D-呋喃果糖分子組成的鏈狀大分子，末端常含有一個葡萄糖基。菊粉酶(inulinase)是一種催化水解菊粉中β-2，1-呋喃果糖苷鍵的水解酶。根據(jù)其對底物的作用方式，可將其分為2類：一類是菊粉外切酶(exoinulinase)，它能從菊粉末端逐一切下一個果糖單位，產物為果糖及少量葡萄糖；另一類是菊粉內切酶(endoinμlinase)，它從菊粉分子內部隨機切斷某個β-2，1-糖苷鍵，水解產物為寡聚糖，可以用來生產低聚果糖。?

低聚果糖（Inulooligosaccharides，IOS）是功能性低聚糖，在食品、醫(yī)藥等方面具有極大的應用價值，相比于蔗糖，具有難消化性、食物纖維的作用、低齲齒性、促進雙歧桿菌的增殖、改善脂質代謝作用等優(yōu)越性，適合現(xiàn)代人們對食品安全性、健康性及功能性等需求的特點，逐漸成為菊粉生物轉化應用中極其重要的方向。?

低聚果糖的生產方法主要有兩種：一種是以蔗糖為原料利用呋喃果糖苷轉移酶(Frucofranosidase)作用來制備，該方法的缺點是反應產物中生成大量的葡萄糖，通常占到35%以上，去除難度大，導致其生產成本的增加；另一種方法是以菊粉為原料利用微生物產出生產用的內切型菊粉酶酶解制備低聚果糖，該方法的優(yōu)點勢是只需一步酶解就可以生成80%以上的高純度低聚果糖，產物中的葡萄糖含量極低，又由于菊粉的來源豐富，價格便宜，使得該方法具有非常廣闊的應用前景。?

用菊粉酶法生產低聚果糖的工藝，對微生物具有較高要求，首先微生物所產的酶液中只能有內切型菊粉酶，而不能有外切酶及轉移酶的存在；第二是微生物所產酶液中菊粉酶的酶活力要高、穩(wěn)定性要好。因此，獲得優(yōu)良的產菊粉內切酶微生物是以菊粉為原料用菊粉酶解法生產低聚果糖能否工業(yè)應用的關鍵。然而自然界菌株中已知具有上述功能菌株一般表達水平很低并且既表達菊粉內切酶也表達菊粉外切酶，使的大規(guī)模生產困難而且產物純化成本很高，所以到目前為止，菊粉內切酶生產低聚果糖的工藝沒有真正實現(xiàn)在工業(yè)生產中規(guī)模化應用。因此，通過生物技術開發(fā)出酶活力高、產量大、熱穩(wěn)定性好的產菊粉內切酶菌株意義重大。經(jīng)檢索，目前具有高水平表達菊粉內切酶單一酶組分的重組畢赤酵母菌株還未見報道。?

發(fā)明內容

針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種高水平表達菊粉內切酶單一酶組分的雙啟動子多拷貝重組畢赤酵母菌株及構建方法與應用。?

本發(fā)明的技術方案概述：分別構建組成型和誘導型兩種啟動子所調控的菊粉內切酶?INU2基因的表達質粒，再將這兩種質粒多拷貝整合在宿主巴斯德畢赤酵母的基因組上，獲得高產菊粉內切酶的雙啟動子多拷貝重組畢赤酵母工程菌株，實現(xiàn)對菊粉內切酶INU2的高水平表達。?

本發(fā)明所述的高產菊粉內切酶INU2的雙啟動子多拷貝重組畢赤酵母工程菌株，其特征在于：所述菌株命名為巴斯德畢赤酵母（Pichia?pastoris）GS115-A3-G2，已于2014年04月16日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏編號為CGMCC?NO：9049。?

上述高產菊粉內切酶INU2的雙啟動子多拷貝重組畢赤酵母工程菌株的構建方法，步驟是：?

克隆菊粉內切酶基因INU2，將菊粉內切酶基因，通過限制性內切酶位點分別與畢赤酵母表達質粒pPIC9K和pGAPZαA連接獲得重組表達載體pPIC9K-INU2和pGAPZαA-INU2；然后將pPIC9K-INU2導入巴斯德畢赤酵母GS115中，通過遺傳霉素G418篩選得到多拷貝AOX啟動子的轉化子，再將pGAPZαA-INU2導入多拷貝AOX啟動子的轉化子中，通過博來霉素抗性篩選獲得多拷貝GAP啟動子的轉化子；用實時熒光定量PCR確定多拷貝轉化子的拷貝數(shù)，對不同拷貝數(shù)的轉化子進行誘導發(fā)酵比較，確定出產量最高的雙啟動子多拷貝轉化子，即獲得高產菊粉內切酶INU2的雙啟動子多拷貝重組畢赤酵母工程菌株。?

上述高產菊粉內切酶INU2的雙啟動子多拷貝重組畢赤酵母工程菌株的構建方法中：所述產量最高的雙啟動子多拷貝轉化子優(yōu)選是GS115-A3-G2，其中：GS115表示巴斯德畢赤酵母基因，A3表示有3個AOX啟動子，G2表示有2個GAP啟動子。?

本發(fā)明所述高產菊粉內切酶INU2的雙啟動子多拷貝重組畢赤酵母工程菌在水解菊粉用于生產低聚果糖中的應用。?