[發(fā)明專利]用于檢測真鯛虹彩病毒的LAMP引物組合物及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410214697.2
• 申請日: 2014-05-20
• 公開（公告）號: CN103966364A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳斌;肇慧君;李葉;劉釗
• 申請（專利權(quán)）人: 吳斌;肇慧君;李葉;劉釗
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責(zé)任公司 21212
• 代理人: 賈漢生;李馨

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及用于檢測真鯛虹彩病毒的LAMP引物組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

我國是世界上最大的水產(chǎn)品生產(chǎn)和輸出國，目前，我國水產(chǎn)品總量已占全球漁業(yè)總產(chǎn)量的40％，連續(xù)15年居世界首位，養(yǎng)殖水產(chǎn)品產(chǎn)量占世界養(yǎng)殖總產(chǎn)量的70％。水產(chǎn)品在保障國家糧食安全、促進(jìn)農(nóng)民增收和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)穩(wěn)步發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。我國水海產(chǎn)品出口面臨的壁壘主要為綠色壁壘，如日本的“肯定列表制度”、歐盟的《歐盟食品及飼料安全管理法規(guī)》及有關(guān)法令、美國的《最嚴(yán)謹(jǐn)?shù)乃a(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)范》(BAP)等，歐盟啟動了對我國進(jìn)口人工養(yǎng)殖海產(chǎn)品的審查；韓國政府也禁止我國34家水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)向韓國出口魚類等水產(chǎn)品，嚴(yán)重制約了我國水產(chǎn)品的出口增長。

真鯛虹彩病毒病(Red sea bream iridovirus disease，RSIVD)是在養(yǎng)殖的海水魚中經(jīng)常發(fā)生并且危害較大的病毒病。該病是由真鯛虹彩病毒((Red sea bream iridovirus，RSIV)引起，該病首次報導(dǎo)是在1990年，在日本四國的真鯛養(yǎng)殖場，養(yǎng)殖的真鯛大量死亡。自1991年，該病就在日本西南部的18個區(qū)流行并造成20多種養(yǎng)殖的海水魚群嚴(yán)重?fù)p失。受感染的包括鱸形目、鰈形目和鲀形目的魚，引起養(yǎng)殖魚群主要是真鯛魚苗的大批死亡，不過也有關(guān)于商品規(guī)格的魚死亡的報導(dǎo)。此后該病就在各種海水養(yǎng)殖魚類中流行并造成很大的損失。1998年該病在韓國流行，引起60％的鯛魚和鱸魚死亡。現(xiàn)在RSIVD已經(jīng)傳到臺灣，據(jù)報道該病使養(yǎng)殖的石斑魚損失很大。我們曾經(jīng)從自臺灣和泰國進(jìn)口過來的鱸魚中檢出過RSIV，由于該病毒造成的危害極大，OIE將其列為重要傳染病。

目前，國內(nèi)外針對病原RSIV的檢測方法已進(jìn)行了相關(guān)研究，但是很多方法耗時長、成本高。因此，需要建立一種針對RSIV的快速、有效、準(zhǔn)確且適合野外現(xiàn)場操作的方法，以達(dá)到及早發(fā)現(xiàn)該病并進(jìn)行隔離或撲殺，達(dá)到抑制疫病大規(guī)模暴發(fā)流行的目的。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是2000年報導(dǎo)的一種新穎核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)的問世解決了核酸診斷上出現(xiàn)的諸多難題，以其高效性、高特異性和反應(yīng)快速的特點被廣泛應(yīng)用于各種病毒、細(xì)菌、寄生蟲以及環(huán)境中細(xì)菌等病原體的檢測研究，取得了可喜的成就。該技術(shù)在目的基因的高保守區(qū)域的6個特異性序列設(shè)計4條引物，運用具有鏈置換活性的DNA聚合酶在60～65℃之間的恒溫條件下反應(yīng)幾十分鐘，就可以完成核酸的擴(kuò)增反應(yīng)。該方法以其便捷、靈敏、特異性高，不需要昂貴的儀器，可在短時間內(nèi)便能完成檢測等優(yōu)點，特別適用于中國進(jìn)出口岸進(jìn)行快速檢驗檢疫，以便保護(hù)水生動物貿(mào)易和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種用于快速、準(zhǔn)確檢測真鯛虹彩病毒(RSIV)的LAMP引物組合物。

本發(fā)明的另一目的在于該LAMP引物組合物在檢測真鯛虹彩病毒中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

一種用于檢測真鯛虹彩病毒的LAMP引物組合物，該引物組合物由序列為SEQ ID No.1所示的正向內(nèi)引物FIP、序列為SEQ ID No.2所示的反向內(nèi)引物BIP、序列為SEQ ID No.3所示的正向外引物F3、序列為SEQ ID No.4所示的反向外引物B3組成。

本發(fā)明還提供上述LAMP引物組合物在檢測真鯛虹彩病毒中的應(yīng)用，包括以下步驟：

(1)提取樣品中的DNA；

(2)以步驟(1)中提取的DNA為模板，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)；

(3)對步驟(2)得到的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

在上述步驟(2)中，LAMP擴(kuò)增反應(yīng)條件為：60-65℃下反應(yīng)30-90分鐘，停止反應(yīng)；最為優(yōu)選的反應(yīng)條件為：62℃下反應(yīng)60分鐘，停止反應(yīng)。