[發(fā)明專利]一種腫瘤抑制蛋白變體及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410214506.2
• 申請(qǐng)日: 2014-05-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103992399A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-08-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬恒標(biāo)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 馬恒標(biāo)
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/47
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/47;A61K38/17;A61P35/00
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及腫瘤抑制蛋白變體。

背景技術(shù)

腫瘤相關(guān)蛋白DENND2D-v2，由468個(gè)氨基酸殘基組成，自序列4的氨基末端第47至145位氨基酸殘基為uDENN結(jié)構(gòu)域，自序列4的氨基末端第146至330位氨基酸殘基為DENN結(jié)構(gòu)域，自序列4的氨基末端第368至435位氨基酸殘基為dDENN結(jié)構(gòu)域。該腫瘤相關(guān)蛋白在小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定高表達(dá)可以明顯抑制該細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化；在mRNA水平檢測(cè)其在細(xì)胞系中的表達(dá)結(jié)果表明，肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著低于原代培養(yǎng)的正常支氣管上皮細(xì)胞；在肺癌臨床組織標(biāo)本中檢測(cè)其表達(dá)水平結(jié)果表明，肺癌組織的表達(dá)水平明顯低于其周邊的正常組織。該腫瘤相關(guān)蛋白可用于腫瘤的體外診斷、預(yù)后。含有上述腫瘤相關(guān)蛋白編碼基因的重組真核表達(dá)載體在導(dǎo)入肺癌細(xì)胞系中后，能單獨(dú)引起肺癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)變緩及致瘤性減弱。因此，該蛋白具有較好的腫瘤藥物應(yīng)用前景。

在現(xiàn)有技術(shù)中，為了提高蛋白的活性，針對(duì)蛋白的活性位點(diǎn)進(jìn)行特異性的突變和取代，從而尋找活性更高的變體是常規(guī)的做法。為了進(jìn)一步提高該蛋白的生物活性，申請(qǐng)人通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)，針對(duì)DENND2D-v2氨基酸序列中特定的位點(diǎn)進(jìn)行了點(diǎn)突變，從而獲得了比DENND2D-v2蛋白本身具有更高抑制活性的變體。

發(fā)明詳述

本發(fā)明涉及親本蛋白的分離的變體，其在至少一個(gè)對(duì)應(yīng)于SEQ?ID?NO：1的成熟多肽的位置53Y、60K、70P、79R、92R、97I、109A、131K、141A、204S、225E、232L、253K、270A、271A、297C、305G、322V、347L、379F、398Q、433Q或451L的位置包含修飾。具體而言，本發(fā)明的變體具有改善的抑制活性。

優(yōu)選地，應(yīng)用于本發(fā)明的方法、呈現(xiàn)改善的抑制活性的蛋白變體包含至少1種任一下述修飾：53Y/F、60K/C、70P/V、79R/K、92R/K、97I/F、109A/S、131K/R、141A/P、204S/T、225E/A、232L/S、253K/V、270A/R、271A/S、297C/R、305G/S、322V/L、347L/R、379F/S、398Q/R、433Q/S、451L/V。

本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白變體的方法，包括(a)培養(yǎng)宿主細(xì)胞；和(b)回收所述蛋白變體。

在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，使用本領(lǐng)域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可以通過(guò)在合適培養(yǎng)基中和允許表達(dá)和/或分離所述多肽的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，和實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無(wú)機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開(kāi)的組成制備(例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌，其能夠從細(xì)胞裂解物(lysate)回收。

所得多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，多肽可以通過(guò)常規(guī)方法從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過(guò)濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。

本發(fā)明的多肽可以通過(guò)多種本領(lǐng)域已知的方法純化，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見(jiàn)，例如，Protein?Purification，J.-C.Janson和Lars?Ryden編，VCH?Publishers，New?York，1989)。

本發(fā)明的多肽用于制備相應(yīng)的藥物，去用于治療癌癥。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：DENND2D-v2基因的獲得

DENND2D-v2：

上游引物5’CACTCCAGGGGCCATGGATG3’

下游引物5’GTCATTCTTATTCACCACAGCTC3’

用上述引物，以人正常肺組織cDNA文庫(kù)(Clontech：K1420-1)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：

反應(yīng)體積50μl，其中含有：

用雙蒸水補(bǔ)足至50μl體積。