[發明專利]一種雙酶合成L-叔亮氨酸的方法

有效

• 申請號: 201410212568.X
• 申請日: 2014-05-19
• 公開（公告）號: CN103981229A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 黃勇開;托馬斯-道斯曼;紀搖搖;徐青;張城孝
• 申請（專利權）人: 寧波酶賽生物工程有限公司
• 主分類號: C12P13/04
• 分類號: C12P13/04
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

技術領域

?本發明涉及L-叔亮氨酸的合成方法，具體涉及一種雙酶合成L-叔亮氨酸的方法。

背景技術

L-叔亮氨酸是個重要的藥物的中間體，是抗艾滋病藥物阿扎那韋、抗丙肝藥物特拉潑維和博賽潑維的主要手性化合物。目前國內外利用酶生物催化生產L-叔亮氨酸的方法有：如公開號為CN101845476，名稱為雙酶體系制備L-叔亮氨酸類化合物的方法發明專利申請，公開了使用酰化氨基酸消旋酶和水解酶拆分的方法，制備L-叔亮氨酸類化合物，雖然方法簡單，但轉化率低于50%。公開號為CN102888431，名稱為一種制備L-叔亮氨酸的方法發明專利申請，公開了利用亮氨酸脫氫酶為生物催化劑，與甲酸脫氫酶偶聯介導輔酶NADH，合成L-叔亮氨酸，雖然輔酶可以循環再生，降低用量，但還原輔酶還原速率較慢，反應時間較長24小時以上。公開號WO2011100265?A2的發明，則公開了用亮氨酸脫氫酶與酮還原酶酶偶聯生產L-叔亮氨酸，該發明反應時間長達24小時，生產成本高。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種輔酶還原速率較快，反應時間較短的雙酶合成L-叔亮氨酸的方法。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種雙酶合成L-叔亮氨酸的方法，步驟如下：

a、配置反應液A：將0.25～1.0g三甲基丙酮酸、質量百分濃度為30%體積為0.47mL的氨水、0.5mL異丙醇加入至摩爾濃度為0.63M體積為2mL的甲酸銨溶液中，攪拌均勻，調節pH值為8.0～9.5；

b、配置反應液B：將7.5mg亮氨酸脫氫酶、7.5mg異丙醇脫氫酶和2.5mg輔酶NADH溶于水中，攪拌均勻，配成2.03mL酶溶液；

c、將反應液A一次或二次加入到反應液B中，在反應溫度25～40℃，攪拌速率每分鐘400轉下反應4～12小時，反應完畢，過濾，得到L-叔亮氨酸固體。反應液A加入方式可以為：一次性倒入到反應液B中或二次性倒入到反應液B中或持續性加入到反應液B中。

反應液A二次性倒入到反應液B中的方法為，先將反應液A1.5mL加入到反應液B中，反應3小時后再將余量反應液A加入到反應液B中。

與現有技術相比，本發明的優點在于一種雙酶合成L-叔亮氨酸的方法，利用亮氨酸脫氫酶與異丙醇脫氫酶偶聯介導輔酶NADH，且在反應液中有終濃度10%左右的異丙醇作用下，異丙醇脫氫酶能迅速將NAD⁺還原為NADH，使反應速度加快，反應時間縮短，提高反應效率，增加了時空產率，同時雙酶的用量也較低，不超過底物質量的3%，反應成本下降，反應產物純度達到99%ee以上，不需在再重結晶拆分。

附圖說明

圖1為本發明的反應式示意圖。

具體實施方式

以下結合附圖、實施例對本發明作進一步詳細描述。

實施例1

一種雙酶合成L-叔亮氨酸的方法，配置反應液A：將0.5g三甲基丙酮酸、濃度為30%體積為0.47mL的氨水、0.5mL異丙醇加入至濃度為0.63M體積為2mL的甲酸銨溶液中，攪拌均勻，調節pH值為9.0；配置反應液B：將7.5mg亮氨酸脫氫酶（市售）、7.5mg異丙醇脫氫酶（購于寧波市麥迪遜醫藥科技有限公司，商品名為111EM006）和2.5mg輔酶NADH（市售）溶于水中，攪拌均勻，配成2.03mL酶溶液；將反應液A一次性全部倒入到反應液B中，在反應溫度40℃，攪拌速率每分鐘400轉下反應4小時，反應完畢，過濾，得到L-叔亮氨酸固體，上述反應過的反應式如圖1所示。

實施例2

與實施例1基本相同，所不同的只是三甲基丙酮酸質量為0.25g，pH值為9.5，反應溫度為25℃，反應時間為8小時。

實施例3

與實施例1基本相同，所不同的只是三甲基丙酮酸質量為1.0g，pH值為8.0，反應溫度為30℃，反應液A分二次倒入到反應液B中：即先將反應液A1.5mL加入到反應液B中，反應3小時后再將余量反應液A加入到反應液B中反應9小時。

實施例4

與實施例1基本相同，所不同的只是三甲基丙酮酸質量為0.75g，反應溫度為35℃，反應液A持續性加入到反應液B中反應6小時：即將反應液A1.5mL緩慢逐漸加入到反應液B中，邊加入加攪拌反應。

上述異丙醇也可以用相似的仲醇替代，甲酸銨溶液也可以用乙酸銨溶液替代。