[發(fā)明專利]將黃色穎殼的水稻品種的穎殼顏色改為褐色的育種方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410210447.1
• 申請日: 2014-05-16
• 公開（公告）號: CN103981212A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發(fā)明（設計）人: 魏鵬程;楊劍波;李莉;宋豐順;馬卉;倪金龍;秦瑞英;李浩;陸徐忠;楊亞春
• 申請（專利權）人: 安徽省農業(yè)科學院水稻研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 北京律譜知識產權代理事務所(普通合伙) 11457
• 代理人: 黃云鐸

1.一種將黃色穎殼的水稻品種的穎殼顏色改為褐色的育種方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

步驟1、在水稻穎殼顏色決定基因OsCAD2外顯子區(qū)中選取以堿基NGG結尾的DNA片段作為靶標片段，其中，N代表堿基A、G、C、T中的任意一種，所述靶標片段位于所述OsCAD2基因外顯子上；

步驟2、利用所述靶標片段，構建用于水稻OsCAD2基因打靶的CRISPR/Cas9重組載體，其中所述重組載體中包含具有所述靶標片段的向導RNA表達框和Cas9核酸酶表達框；

步驟3、將所述重組載體導入水稻細胞，誘導含有所述靶標片段的向導RNA表達框和Cas9核酸酶表達框在水稻細胞中共同表達，剪切OsCAD2基因的雙鏈靶標片段，再通過水稻細胞自身的DNA修復功能，在靶標位點隨機插入或缺失堿基，實現(xiàn)水稻細胞內OsCAD2基因的功能缺失突變；

步驟4、用導入所述重組載體的水稻細胞再生若干水稻植株；

步驟5、對再生的水稻植株中OsCAD2基因包含所述靶標片段的DNA區(qū)段測序；

步驟6、選擇兩個等位OsCAD2基因都出現(xiàn)功能缺失突變的再生株系，進行表型觀察，選取穎殼顏色變褐的株系。

2.根據(jù)權利要求1所述的育種方法，其特征在于，所述靶標片段中的一條鏈具有5’-(N)_X-NGG-3’結構，(N)_X表示數(shù)目為X的一條堿基序列{N₁,N₂……N_x}，N₁,N₂……N_x中的每一個表示A、G、C、T中的任意一個。

3.根據(jù)權利要求2所述的育種方法，其特征在于，X為19或20。

4.根據(jù)權利要求1所述的育種方法，其特征在于，所述功能缺失突變?yōu)檎sCAD2編碼序列在靶標位點出現(xiàn)終止子或閱讀框移位。

5.根據(jù)權利要求1所述的育種方法，其特征在于，所述重組載體包含能夠在水稻細胞內表達的向導RNA表達框，其核苷酸序列如Seq?ID?No.1所示，所述重組載體還包含能夠在水稻細胞內表達的Cas9核酸酶表達框，其核苷酸序列如Seq?ID?No.2所示。

6.根據(jù)權利要求5所述的育種方法，其特征在于，

所述向導RNA表達框包括：水稻U6啟動子，其核苷酸序列如Seq?ID?No.1第1至246位所示；結構特征為(N)_X的靶標序列和人工合成的sgRNA骨架序列，其核苷酸序列如Seq?ID?No.1第267至350位所示；以及Poly-T終止子，其核苷酸序列如Seq?ID?No.1第351至358位所示。

7.根據(jù)權利要求5所述的育種方法，其特征在于，

所述Cas9核酸酶表達框包括玉米ZmUBI啟動子，其核苷酸序列如Seq?ID?No.2第1至2031位所示，植物偏好密碼子改造后的Cas9編碼序列，其核苷酸序列如Seq?ID?No.2第2034至6305位所示；以及tNOS終止子，其核苷酸序列如Seq?ID?No.2第6347至6599位所示。