[發(fā)明專利]一種PCR檢測鑒定地中海白蝸牛的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410209891.1
• 申請日: 2014-05-17
• 公開（公告）號: CN103952491A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王沛;周衛(wèi)川;陸軍;林陽武;肖瓊;崔俊霞
• 申請（專利權(quán)）人: 福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測鑒定領(lǐng)域，具體涉及一種PCR檢測鑒定地中海白蝸牛的方法。

背景技術(shù)

地中海白蝸牛Cernuella?virgata?(Da?Costa,?1778）屬于柄眼目Stylommatopgora、濕螺科Hygromiidae，是國際上倍受關(guān)注的檢疫性有害生物，美國、智利、日本、新西蘭、澳大利亞等國家和地區(qū)對其實施檢疫。2012年9月該螺被增補為《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名單》中的成員，其貝殼與同科比薩茶蝸牛Theba?pisana?Müller等極為相似，往往難以區(qū)分，且只有資深的陸生軟體動物分類專家才能鑒別，卵粒和幼螺的鑒定則更為困難。由于歷史的原因，目前國境口岸的植物檢疫人員絕大多數(shù)為植物保護(hù)專業(yè)，對陸生軟體動物的分類知之甚少，這種局面給我國的實際檢疫工作造成了被動，也是世界各國檢驗檢疫部門共同面臨的技術(shù)難題。最近二十多年來，分子系統(tǒng)學(xué)飛速發(fā)展，即由基因序列的比較可以厘清物種的分類學(xué)與系統(tǒng)學(xué)地位。因此可以將形態(tài)和分子特征結(jié)合起來，對地中海白蝸牛及其近似種的分類學(xué)進(jìn)行更為深入而詳盡的研究，為地中海白蝸牛的快速準(zhǔn)確鑒定提供新的技術(shù)手段。而PCR技術(shù)在國境口岸檢疫部門已經(jīng)相當(dāng)普及，如果能設(shè)計出特異性引物用PCR擴增方法進(jìn)行初篩或鑒定，這個難題就迎刃而解。本發(fā)明建立了一種PCR方法檢測鑒定地中海白蝸牛的技術(shù)，以適應(yīng)當(dāng)前國境口岸檢疫工作的需要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定技術(shù)所存在的不足開展研究，旨在提供一種準(zhǔn)確性好、靈敏度高、成本低廉的檢測方法，應(yīng)用于地中海白蝸牛的快速檢測鑒定。

本發(fā)明提供了一種PCR檢測鑒定地中海白蝸牛的方法，所述方法是應(yīng)用特異性引物對地中海白蝸牛的分子特征進(jìn)行識別，所述引物為：

上游引物為HP-(P1)：5’-?GTTATTGTTACTGCTCACGC?-3’，

下游引物為HP-(P2)：5’-?CTGCTAAGACAGGGAGAGAT?-3’。

本發(fā)明的PCR反應(yīng)體系總體積為25μL，其中2×Taq?PCR?MasterMix混合液12.5μL，上、下游引物各0.5μL，DNA模板3μL，余下用滅菌ddH₂O補足。

所述PCR反應(yīng)的程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃?30s，46℃?30s，72℃，1min，25個循環(huán)；72℃?延伸10min，結(jié)束反應(yīng)。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點：本發(fā)明方法能夠快速、準(zhǔn)確地檢測鑒定地中海白蝸牛。本發(fā)明為植物檢疫中對檢疫性有害生物地中海白蝸牛的檢測鑒定提供了新的技術(shù)手段，對于防止地中海白蝸牛的傳入和擴散具有重要意義。本發(fā)明所提供的一種PCR檢測鑒定地中海白蝸牛的方法具有以下有益效果：

1、結(jié)果可靠：本發(fā)明所設(shè)計出的一種檢測鑒定地中海白蝸牛的特異性引物，僅針對地中海白蝸牛進(jìn)行檢測，已經(jīng)對近緣種比薩茶蝸牛、花園蔥蝸牛、蓋罩大蝸牛、亮大蝸牛等共計14種代表性蝸牛進(jìn)行了測試驗證，因此結(jié)果可靠性具有充分的保證。

2、特異性強：所采用的引物是針對地中海白蝸牛的COI基因序列設(shè)計出的特異性引物，特異性高。

3、靈敏度高：對地中海白蝸牛的檢測靈敏度在DNA水平上可達(dá)到?1?pg/μL。

4、實用性好：當(dāng)傳統(tǒng)分類學(xué)方法難以鑒定地中海白蝸牛時，本發(fā)明方法用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行彌補，從而得到快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的檢測鑒定地中海白蝸牛的PCR方法。因此本方法的實用性強，可滿足對地中海白蝸牛進(jìn)行快速可靠的檢測和鑒定的需要。

附圖說明