[發明專利]一種PCR檢測鑒定地中海白蝸牛的方法

有效

• 申請號: 201410209891.1
• 申請日: 2014-05-17
• 公開（公告）號: CN103952491A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發明（設計）人: 王沛;周衛川;陸軍;林陽武;肖瓊;崔俊霞
• 申請（專利權）人: 福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明涉及分子生物學檢測鑒定領域，具體涉及一種PCR檢測鑒定地中海白蝸牛的方法。

背景技術

地中海白蝸牛Cernuella?virgata?(Da?Costa,?1778）屬于柄眼目Stylommatopgora、濕螺科Hygromiidae，是國際上倍受關注的檢疫性有害生物，美國、智利、日本、新西蘭、澳大利亞等國家和地區對其實施檢疫。2012年9月該螺被增補為《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名單》中的成員，其貝殼與同科比薩茶蝸牛Theba?pisana?Müller等極為相似，往往難以區分，且只有資深的陸生軟體動物分類專家才能鑒別，卵粒和幼螺的鑒定則更為困難。由于歷史的原因，目前國境口岸的植物檢疫人員絕大多數為植物保護專業，對陸生軟體動物的分類知之甚少，這種局面給我國的實際檢疫工作造成了被動，也是世界各國檢驗檢疫部門共同面臨的技術難題。最近二十多年來，分子系統學飛速發展，即由基因序列的比較可以厘清物種的分類學與系統學地位。因此可以將形態和分子特征結合起來，對地中海白蝸牛及其近似種的分類學進行更為深入而詳盡的研究，為地中海白蝸牛的快速準確鑒定提供新的技術手段。而PCR技術在國境口岸檢疫部門已經相當普及，如果能設計出特異性引物用PCR擴增方法進行初篩或鑒定，這個難題就迎刃而解。本發明建立了一種PCR方法檢測鑒定地中海白蝸牛的技術，以適應當前國境口岸檢疫工作的需要。

發明內容

本發明針對傳統形態學鑒定技術所存在的不足開展研究，旨在提供一種準確性好、靈敏度高、成本低廉的檢測方法，應用于地中海白蝸牛的快速檢測鑒定。

本發明提供了一種PCR檢測鑒定地中海白蝸牛的方法，所述方法是應用特異性引物對地中海白蝸牛的分子特征進行識別，所述引物為：

上游引物為HP-(P1)：5’-?GTTATTGTTACTGCTCACGC?-3’，

下游引物為HP-(P2)：5’-?CTGCTAAGACAGGGAGAGAT?-3’。

本發明的PCR反應體系總體積為25μL，其中2×Taq?PCR?MasterMix混合液12.5μL，上、下游引物各0.5μL，DNA模板3μL，余下用滅菌ddH₂O補足。

所述PCR反應的程序為：94℃預變性5min；94℃?30s，46℃?30s，72℃，1min，25個循環；72℃?延伸10min，結束反應。

本發明的顯著優點：本發明方法能夠快速、準確地檢測鑒定地中海白蝸牛。本發明為植物檢疫中對檢疫性有害生物地中海白蝸牛的檢測鑒定提供了新的技術手段，對于防止地中海白蝸牛的傳入和擴散具有重要意義。本發明所提供的一種PCR檢測鑒定地中海白蝸牛的方法具有以下有益效果：

1、結果可靠：本發明所設計出的一種檢測鑒定地中海白蝸牛的特異性引物，僅針對地中海白蝸牛進行檢測，已經對近緣種比薩茶蝸牛、花園蔥蝸牛、蓋罩大蝸牛、亮大蝸牛等共計14種代表性蝸牛進行了測試驗證，因此結果可靠性具有充分的保證。

2、特異性強：所采用的引物是針對地中海白蝸牛的COI基因序列設計出的特異性引物，特異性高。

3、靈敏度高：對地中海白蝸牛的檢測靈敏度在DNA水平上可達到?1?pg/μL。

4、實用性好：當傳統分類學方法難以鑒定地中海白蝸牛時，本發明方法用分子生物學技術進行彌補，從而得到快速、準確、靈敏度高的檢測鑒定地中海白蝸牛的PCR方法。因此本方法的實用性強，可滿足對地中海白蝸牛進行快速可靠的檢測和鑒定的需要。

附圖說明