[發明專利]一種延長水稻生育期的育種方法

有效

• 申請號: 201410209121.7
• 申請日: 2014-05-16
• 公開（公告）號: CN104004782A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 秦瑞英;楊劍波;魏鵬程;李莉;馬卉;李浩;楊亞春;倪金龍;倪大虎;宋豐順;陸徐忠
• 申請（專利權）人: 安徽省農業科學院水稻研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京律譜知識產權代理事務所(普通合伙) 11457
• 代理人: 黃云鐸

1.一種延長水稻生育期的育種方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：?

步驟1，在水稻生育期決定基因Ehd3外顯子區選取靶標片段，所述靶標片段的雙鏈結構的一條鏈具有5’-(N)_X-NGG-3’結構，(N)_X代表數目為X的一段堿基序列{N₁,N₂……N_x}，X代表堿基的數量，N₁,N₂……N_x中的每一個表示A、G、C、T中的任意一個，NGG中的N也表示A、T、G、C中的一種；?

步驟2，利用所述靶標片段，構建用于水稻Ehd3基因打靶的CRISPR/Cas9重組載體，其中所述重組載體中包含具有所述靶標片段的向導RNA表達框，以及Cas9核酸酶表達框；?

步驟3，將所述重組載體導入水稻細胞，誘導所述向導RNA表達框和所述Cas9核酸酶表達框在水稻細胞中共同表達；?

步驟4，剪切Ehd3基因的雙鏈靶標片段，誘發水稻細胞自身的DNA修復功能，在靶標位點隨機插入或缺失堿基，實現細胞內Ehd3基因的功能缺失突變；?

步驟5，用導入所述重組載體的水稻細胞再生水稻植株；?

步驟6，對再生植株中Ehd3基因包含靶標片段的DNA區段測序。?

步驟7，選擇兩個等位Ehd3基因都出現功能缺失突變的再生株系，進行表型鑒定，觀察再生株系子代的生育期，挑取生育期推遲超過預定時間段的株系，作為所創制的生育期推遲的水稻材料。?

2.根據權利要求1所述的育種方法，其特征在于，X為19或20。?

3.根據權利要求1所述的育種方法，其特征在于，所述向導RNA表達框和所述Cas9核酸酶表達框均能夠在水稻細胞中表達。?

4.根據權利要求3所述的育種方法，其特征在于，所述向導RNA表?達框的核苷酸序列如Seq?ID?No.1所示；所述Cas9核酸酶表達框的核苷酸序列如Seq?ID?No.2所示。?

5.根據權利要求3所述的育種方法，其特征在于，?

所述向導RNA表達框包括：水稻U6啟動子，其核苷酸序列如Seq?ID?No.1第1至246位所示；結構特征為(N)_X的靶標序列和人工合成的sgRNA骨架序列，其核苷酸序列如Seq?ID?No.1第267至350位所示；以及Poly-T終止子，其核苷酸序列如Seq?ID?No.1第351至358位所示。?

6.根據權利要求3所述的育種方法，其特征在于，?

所述Cas9核酸酶表達框包括：玉米ZmUBI啟動子，其核苷酸序列如Seq?ID?No.2第1至2031位所示；植物偏好密碼子改造后的Cas9編碼序列，其核苷酸序列如Seq?ID?No.2第2034至6305位所示；以及tNOS終止子，其核苷酸序列如Seq?ID?No.2第6347至6599位所示。?

7.根據權利要求1所述的育種方法，其特征在于，在所述步驟7中，挑取子代生育期推遲超過兩周的株系作為所創制的生育期推遲的水稻材料。?

8.根據權利要求1所述的育種方法，其特征在于，所述步驟7還包括對所得植株進行自交，觀察再生株系子代的生育期。?