[發(fā)明專利]多個microRNAs復合檢測的引物設(shè)計方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410209010.6
• 申請日: 2014-05-16
• 公開（公告）號: CN104120174A
• 公開（公告）日: 2014-10-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 侯一平;顏靜;李巖;魏蔚;張霽
• 申請（專利權(quán)）人: 四川大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 成都虹橋?qū)＠聞账?普通合伙) 51124
• 代理人: 梁鑫

1.用于microRNAs檢測的引物，其特征在于：包括特異性逆轉(zhuǎn)錄引物REP、上游引物PF和下游引物PR；所述的特異性逆轉(zhuǎn)錄引物REP從5’端到3’端方向依次包括接頭序列ADP和P1，所述ADP從5’端到3’端依次為非人類基因組的特殊序列NHS和TTTTC序列，所述P1為與待測miRNA標記3’末端互補的6～8個堿基；所述NHS的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，所述TTTTC序列的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示。

2.如權(quán)利要求1所述的用于microRNAs檢測的引物，其特征在于：所述上游引物PF從5’端到3’端方向依次包括非人類基因組序列TAS和P2；所述TAS的核苷酸序列如SEQ?ID?No.4所示；所述P2為待測miRNA標記序列中除P1的互補序列以外的堿基序列，且將U替換為T。

3.如權(quán)利要求1或2所述的用于microRNAs檢測的引物，其特征在于：所述下游引物PR從5’端到3’端方向依次包括非人類基因組序列TAF和NHS；所述TAF的核苷酸序列如SEQ?ID?No.5。

4.如權(quán)利要求1～3任一項所述的用于microRNAs檢測的引物，其特征在于：在上游引物PF或下游引物PR的5’端標記熒光物質(zhì)。

5.用于microRNAs檢測的試劑盒，其特征在于：包括特異性逆轉(zhuǎn)錄引物REP、上游引物PF和下游引物PR；所述的特異性逆轉(zhuǎn)錄引物REP從5’端到3’端方向依次包括接頭序列ADP和P1，所述ADP從5’端到3’端依次為非人類基因組的特殊序列NHS和TTTTC序列，所述P1為與待測miRNA標記3’末端互補的6～8個堿基；所述NHS的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，所述TTTTC序列的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示。

6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于：所述上游引物PF從5’端到3’端方向依次包括非人類基因組序列TAS和P2；所述TAS的核苷酸序列如SEQ?ID?No.4所示；所述P2為待測miRNA標記序列中除P1的互補序列以外的堿基序列，且將U替換為T。

7.如權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于：所述下游引物PR從5’端到3’端方向依次包括非人類基因組序列TAF和NHS；所述TAF的核苷酸序列如SEQ?ID?No.5。

8.如權(quán)利要求5～7任一項所述的試劑盒，其特征在于：在上游引物PF或下游引物PR的5’端標記熒光物質(zhì)。

9.檢測microRNAs的引物的制備方法，其特征在于：包括特異性逆轉(zhuǎn)錄引物REP的制備、上游引物PF的制備和下游引物PR的制備；所述特異性逆轉(zhuǎn)錄引物REP的制備包括如下步驟：1)引物序列的確定：確定待檢測的miRNA標記的序列信息，采用可與待測miRNA標記3’末端互補的6～8個堿基為逆轉(zhuǎn)錄引物中的特異性序列P1，在特異性序列P1的5’末端加上一段接頭序列ADP，所述ADP從5’端到3’端依次為非人類基因組的特殊序列NHS和TTTTC序列，所述NHS的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，所述TTTTC序列的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示；2)制備得到確定序列的引物。

10.如權(quán)利要求9所述的檢測microRNAs的引物的制備方法，其特征在于：上游引物PF的制備包括如下步驟：1)引物序列的確定：采用待測miRNA標記序列中除前述特異性序列P1的互補序列以外的堿基序列為待測miRNA標記上游的特異性PCR引物P2，并將U替換為T，在待測miRNA標記上游的特異性PCR引物P2的5’末端加上一段非人類基因組序列TAS，TAS的核苷酸序列如SEQ?ID?No.4所示；2)制備得到確定序列的引物。

11.如權(quán)利要求9或10所述的檢測microRNAs的引物的制備方法，其特征在于：1)引物序列的確定：從5’端到3’端方向依次包括非人類基因組序列TAF和NHS；所述TAF的核苷酸序列如SEQ?ID?No.5；2)制備得到確定序列的引物。

12.如權(quán)利要求9～11任一項所述的檢測microRNAs的引物的制備方法，其特征在于：在上游引物PF或下游引物PR的5’端標記熒光物質(zhì)。