[發明專利]一種調控小黑楊抗銹菌侵染基因表達的miRNA及其應用

有效

• 申請號: 201410208679.3
• 申請日: 2014-05-16
• 公開（公告）號: CN104059910A
• 公開（公告）日: 2014-09-24
• 發明（設計）人: 王峰;李丹蕾;王志英;鄒莉;陳俏麗
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 侯靜

技術領域

本發明涉及一種調控抗銹菌侵染基因表達的miRNA及其應用。

背景技術

MicroRNAs(miRNAs)是具有調控基因表達作用的內源非編碼小RNA(smallRNAs)，它們主要是通過結合靶基因mRNA或靶基因mRNA的3’非翻譯區(3’-untranslated region，3’-UTR)來降解該基因mRNA或者阻礙其翻譯，從而在轉錄后水平控制基因表達。最早發現的miRNA是在線蟲中觀察到的與靶基因轉錄物的3’-UTR互補的長18-22nt的RNA分子，包括lin-4和let-7基因，線蟲的發育由這些RNA基因所調控。隨后miRNA被發現在包括從線蟲到果蠅以及人的多種組織中存在，對植物miRNA的報導始于2002年。隨著現代生物技術和分子生物學的發展，植物miRNA的發現數量呈指數增長。目前，miRNA數據庫miRBase中已登記了1160多條植物miRNA序列及相關信息。植物miRNA的發現及其在植物生長發育和脅迫應答中的作用是植物分子生物學研究領域的一大熱點。大量研究發現，植物miRNAs主要依靠與靶基因之間完全或近乎完全的互補配對切割靶基因或翻譯抑制實現其調控功能，在調節植物生長發育、細胞增殖、生物及非生物脅迫響應中發揮重要作用。

楊樹是重要的用材林樹種，具有較大的經濟效益和生態效益。由落葉松-楊柵銹菌(Melampsora larici-populina)引起的楊銹病是楊樹的主要病害之一。近年來，其為害日趨嚴重。利用基因工程技術培育抗銹病楊樹品種是重要的防病手段。利用基因工程改良楊樹抗病性依賴于對楊樹抗病相關基因及其調控元件的認識。植物抗病反應是多種生理過程相互調控的綜合反應。目前有關楊樹抗銹菌侵染的分子研究主要集中在一些直接參與楊樹抗真菌侵染抗性效應的功能基因和蛋白質中，而忽略了導致諸多基因差異表達的幕后操縱者，即這些防衛反應相關基因的上游調控網絡是研究中的盲點。近年來發現植物microRNA在植物生長發育和脅迫應答中具有重要的調控作用。如果逆向探尋上游的調節分子，找到處于楊樹抗銹菌分子網絡中的“始作俑者”-microRNA，并對楊樹抗銹菌基因與其對應的microRNA調控過程進行深入研究，或可揭示銹菌侵染過程中楊樹基因表達調控的完整過程并為楊樹抗銹菌研究應用于生產實踐開辟新的道路。

發明內容

本發明提供一種調控小黑楊抗銹菌侵染基因表達的miRNA及其應用。

本發明調控小黑楊抗銹菌侵染基因表達的miRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

上述調控小黑楊抗銹菌侵染基因表達的miRNA前體序列如SEQ ID NO：2所示。

上述調控小黑楊抗銹菌侵染基因表達的miRNA可調控小黑楊對銹病的抗性，用于抗病育種。

本發明構建落葉松-楊柵銹菌(Melampsora larici-populina)侵染前后的小黑楊(Populus simonii×P.nigra)小RNA文庫，采用Illumina測序技術測序，獲得一條新miRNA，命名為Pn-5p-310376_3，該miRNA在銹菌接種后表達上調(log2＝12.64)。通過構建降解組，發現其靶基因為NB-ARC(nucleotide binding inAPAF-1，plant disease resistance gene products andCED-4)抗性蛋白基因(Potri.014G002000.1)，剪切位點為752nt。

在銹菌侵染后表達量上調，表明該miRNA在小黑楊抗銹菌侵染過程中起作用。鑒于該miRNA調控的靶基因為NB-ARC抗性蛋白基因(NB-ARC抗性蛋白基因編碼含有核苷酸結合位點的植物抗病蛋白)，更進一步說明該miRNA在楊樹抗病過程中起到關鍵作用。通過對該miRNA及其靶基因的研究，在楊樹抗病育種中具有重要的生物學意義和潛在的應用價值。

附圖說明

圖1為調控小黑楊抗銹菌侵染基因表達的miRNA前體序列的莖環結構圖；圖2為實施例1中小黑楊葉片總RNA的電泳圖。

具體實施方式

以下的實施例便于更好的理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料及設備，如無特殊說明，均通過市場購買直接獲得。