[發明專利]鎘離子膠體金免疫層析檢測試紙條及其制備方法與應用

無效

• 申請號: 201410208120.0
• 申請日: 2014-05-16
• 公開（公告）號: CN104007262A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 劉博;林親錄;羅非君;楊濤;汪龍;肖華西
• 申請（專利權）人: 中南林業科技大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/531
• 代理公司: 長沙星耀專利事務所 43205
• 代理人: 寧星耀;許伯嚴

1.?鎘離子膠體金免疫層析檢測試紙條，其特征在于，按照以下方法制備而成：?

（1）抗鎘離子單抗的制備和純化：用雙功能乙烯基二胺-N,N,N’,N’-四乙酸螯合劑將鎘離子偶聯到牛血清蛋白上，混合弗氏不完全佐劑免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合，篩選出穩定分泌抗鎘離子單克隆抗體的陽性細胞株并擴大培養，注射細胞進小鼠體內誘生腹水；取2-4?ml腹水，加入相當于腹水體積1.8－2.2倍的醋酸鈉緩沖液，調節pH到4.0-5.0，得混合液；于室溫攪拌下逐滴加入辛酸，所述辛酸與所述混合液的體積比為30-40μl/ml；2-8℃下靜置、離心，得到上清液；調節pH到7.0-7.8，2-8℃冷水浴下加入硫酸銨，控制硫酸銨終濃度為0.25-0.30g/ml，靜置1-2h；然后2-8℃、8000-12000r/min離心10-20min，棄上清液，將沉淀溶于0.008-0.012mol/L的磷酸鹽緩沖溶液中進行透析，2-8℃靜置過夜，8000-12000r/min離心10-20min，棄沉淀；得到抗鎘離子單抗；

（2）檢測抗原鎘-乙烯基二胺-N,N,N’,N’-四乙酸-牛血清蛋白的制備：取乙烯基二胺-N,N,N’,N’-四乙酸以質量體積比為15－25mg/ml溶于二甲基亞砜中形成A液；將兔抗牛血清蛋白以質量體積比為15-16mg/ml溶于三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽中，分別加入占三羥甲基甲烷鹽酸鹽體積1-2%的三乙胺和聚乙二醇600，形成B液；將A液逐滴加入B液中，所述Ａ液與Ｂ液體積比為1:0.8-1.2，震蕩12-24h；用超濾管離心，得到乙烯基二胺-N,N,N’,N’-四乙酸-牛血清蛋白；取硝酸鎘以質量體積比為10-12mg/ml溶于二甲基亞砜中形成C液；將C液逐滴加入到乙烯基二胺-N,N,N’,N’-四乙酸-牛血清蛋白中，乙烯基二胺-N,N,N’,N’-四乙酸-牛血清蛋白與Ｃ液的體積比為1:0.8-1.2，震蕩2-5h；用超濾管離心，得到檢測抗原鎘-乙烯基二胺-N,N,N’,N’-四乙酸-牛血清蛋白；

（3）膠體金溶液的制備：取質量濃度為0.008-0.012%的氯金酸水溶液80-120ml，攪拌加熱至沸騰，一次性快速加入質量濃度為0.8-1.2%的檸檬酸三鈉水溶液2-3ml，繼續攪拌加熱0.5-24h，直至溶液呈酒紅色，室溫冷卻，得到含有粒徑為20－40nm的膠體金顆粒的膠體金溶液；

（4）抗鎘離子單抗標記的膠體金溶液的制備：取步驟（3）所得膠體金溶液80-120ml，用摩爾濃度為0.2-0.3mol/L的碳酸鉀溶液將其pH值調至8.3-8.8；將步驟（1）所得抗鎘離子單抗1.2-2.0mg加入到膠體金溶液中，攪拌均勻，靜置0.5－24小時；逐滴加入質量濃度為8-12%的無菌牛血清蛋白8-14ml，攪拌0.5－24h，4℃－30℃靜置過夜；將標記后的膠體金溶液于12000－14000r/min離心20-60min，棄去上清液，加入摩爾濃度0.01-0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液2-6ml重懸，得到抗鎘離子單抗標記的膠體金溶液；

（5）噴金：把步驟（4）所得抗鎘離子單抗標記的膠體金溶液按2－10μl/cm的噴量噴在結合墊上，37℃－45℃抽風烘干，時間為5－24h，得到噴金后的結合墊；

??（6）硝酸纖維素膜上包被C,T線：在硝酸纖維素膜上包被C線和T線，其中C線為質控線，包被羊抗鼠免疫球蛋白G，濃度為0.2－1.5mg/ml；T線為檢測線，包被鎘的檢測抗原鎘-乙烯基二胺-N,N,N’,N’-四乙酸-牛血清蛋白，濃度為0.1－0.9mg/ml；37℃－45℃抽風烘干，時間為2－24h；得到包被后的硝酸纖維素膜；

所述包被后的硝酸纖維素膜上設置檢測T線和質控C線，其中檢測線T線靠近樣品墊一端；?

??（7）鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條的組裝：將聚氯乙烯底板、樣品墊、步驟（5）所得噴金后的結合墊、步驟（6）所得包被后的硝酸纖維素膜和吸水紙組裝，切割成條，得到鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條；

組裝方式如下：以聚氯乙烯底板為底部支撐，將樣品墊、噴金后的結合墊、包被后的硝酸纖維素膜和吸水紙以依次相連的方式粘貼在聚氯乙烯底板上制成；其中樣品墊和吸水紙位于兩端，包被后的硝酸纖維素膜的兩端分別位于結合墊和吸水紙的下面，結合墊的一端設置于樣品墊的下面，另一端設置于包被后的硝酸纖維素膜的上面；

所述結合墊和樣品墊是將聚酯膜經過混合液浸泡5－24h，取出后于37－45℃抽風烘干得到；所述混合液為摩爾濃度為0.01－0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液、質量體積比為3g－6g/（100ml磷酸鹽緩沖液）的非離子表面活性劑、體積比為1ml－4ml/（100ml磷酸鹽緩沖液）的吐溫20和質量體積比為5g－20g/（100ml磷酸鹽緩沖液）的聚乙二醇6000組成的，所述磷酸鹽緩沖液的pH值為7.0－7.5。