[發明專利]活性污泥中總DNA的凍融改良式提取方法及其應用

有效

• 申請號: 201410208061.7
• 申請日: 2014-05-18
• 公開（公告）號: CN103966202B
• 公開（公告）日: 2017-05-17
• 發明（設計）人: 李艷紅;解慶林;朱宗強;曾鴻鵠;梁延鵬;王帥;陳有為
• 申請（專利權）人: 桂林理工大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于環境科學領域，特別涉及一種活性污泥中總DNA的凍融改良式提取方法及其應用。

背景技術

從天然的巖石下面采出的油水混合物經過油水分離后產生的水就叫采油廢水。采油廢水中含有許多有機和無機物，而且不同的油田所處的地理位置，地質結構，油田的開采壽命，開采石油烴的種類不同，所產生的采油廢水的種類也不同。另外，由于鉆井污水、洗井污水、生活污水等污水的混入，使得采油廢水的成分更加復雜。通常情況下，采油廢水有以下特點：(1)含油量高。通常采油廢水中的原油含量可達1000-2000mg/L，部分油田的廢水中的含油量甚至可達5000mg/L以上。依據含油顆粒在廢水中的粒徑可將其分為浮油、分散油、乳化油和溶解油。粒徑大于100μm的浮油和10-100μm 的分散油占廢水中總含油量的90%左右，0.1-10μm的乳化油占10%，小于0.1μm的溶解油含量很低。(2)含鹽量高。油田采油污水所含的鹽主要是無機鹽，一般不同的油田甚至不同區塊、油層的含鹽量都不同，從幾千到十幾萬毫克升不等。所含的無機鹽離子主要包括：Ca²⁺、Mg²⁺、K⁺、Na⁺、Fe²⁺、Cl^?、SO₄^2?、HCO₃^?和CO₃^2?等。(3)含懸浮固體顆粒。一般是1-100μm的顆粒，主要包括粘土顆粒、粉砂和細砂等。(4)含細菌。一般以腐生菌和硫酸鹽還原菌居多。(5)有些還含表面活性劑。此外，采油廢水還有高溫(40-80℃)和高pH值的特點。

采油廢水的處理可采用物理法、化學法、生物法、膜法及其相結合的方法。在這些處理方法中生物處理法因其運行費用低，操作簡便等特點而被廣泛的應用。通常對采油廢水處理的生物處理法可分為：活性污泥法、生物膜法、生物接觸氧化池、氧化塘等。活性污泥法是在處理可生物降解的污水中最常見的技術，該方法對廢水的處理可分為生物和物理兩個階段，在生物階段主要是活性污泥中的微生物降解廢水中的有機物、銨鹽和磷酸鹽等物質。在該技術中對處理效果起關鍵性作用的就是活性污泥中微生物的活性，而微生物的活性又由活性污泥中微生物的群落結構和特征所決定。活性污泥中的微生物群落很豐富，主要由細菌、真菌、古菌、放線菌、藻類、原生動物和后生動物等構成，其中最主要的是細菌，大約占整個活性污泥微生物群落的95%。因此，細菌是活性污泥廢水處理系統中有機物、銨鹽和磷酸鹽等物質有效去除的重要保障。然而，對細菌的菌種鑒定、篩選和基因工程菌的合成中，DNA的高效提取為其關鍵技術，因此，國內外大量學者開展DNA提取方法研究。采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）+梯度反復凍融法+溶菌酶+蛋白酶法開展菌種DNA提取研究，利于分析采油廢水處理系統活性污泥中細菌、真菌在種類和數量上的變化。研究結果可為后續活性污泥篩選高效除油菌株、構建高效除油復合菌群提供理論依據，同時對指導實際生產運行具有重要意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種活性污泥中總DNA的凍融改良式提取方法及其應用。

本發明的思路：充分利用梯度反復凍融法的優勢，改良“CTAB+凍融+溶菌酶+蛋白酶法”DNA提取法，并應用到高鹽度采油廢水生物處理系統的活性污泥DNA的高效提取中。

本發明的機理：利用CTAB對傳統DNA提取緩沖液進行改良，利用梯度冷凍并溶出的方法有效分離所需DNA片段，再應用溶菌酶和蛋白酶法完成高鹽度采油廢水凈化系統中活性污泥的DNA高效提取。

具體步驟為：

(1)均勻取得目標DNA來源體污泥20~30mL，其含水率大于98%，置于100mL離心管中，以6000~8000r/min的轉速進行離心預處理5~8min，棄去上清液，過快速濾紙收集沉淀物質待用，所收集的沉淀物質小于1mL。

(2)將步驟(1)所收集的沉淀物質加入到2mL的具塞離心管中，并加入1~2mL的DNA提取緩沖液，漩渦振蕩器振蕩5~10min后待用；所述DNA提取緩沖液含有100~150mmol/L的EDTA、100~150mmol/L的Tris-HCl、1.5~3.0mol/L的NaCl、質量百分比濃度為2~5% 的CTAB和質量百分比濃度為1~3% 的PVPP，并使用0.1~0.5mol/L的HCl和NaOH稀溶液調節DNA提取緩沖液的pH值至8.0。