[發明專利]三個抗草丁膦水稻細胞質型谷氨酰胺合成酶突變體

在審

• 申請號: 201410207844.3
• 申請日: 2014-05-17
• 公開（公告）號: CN104164441A
• 公開（公告）日: 2014-11-26
• 發明（設計）人: 趙偉;姚泉洪;彭日荷
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N9/00;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/865
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬生物技術領域，具體涉及一組由人工合成的野生型水稻谷氨酰胺合成酶經DNA改組（DNA?shuffling）技術得到的突變基因，該組基因編碼的谷氨酰胺合成酶對草丁膦的抗性顯著增強。該發明所述的基因可用于構建轉化植物的表達載體。

背景技術

轉基因抗草丁膦作物是僅次于抗草甘膦作物的第二位抗除草劑作物，已商業化的耐草丁膦作物有玉米、油菜、甜菜、棉花等。2001年加拿大種植的400萬公頃油菜中，80％是抗除草劑品種，其中抗草甘膦油菜占47％，抗草丁膦油菜占l3％。草丁膦的殺草原理是它能抑制谷氨酰胺合成酶(Glutamine?synthetase，GS)，使氨在植物體內迅速積累，光合作用和光呼吸停止，葉綠體受損，從而導致雜草死亡。常規作物不具有降解草丁膦的能力，如果直接接觸，草丁膦會殺死常規作物。耐草丁膦作物（商品名叫Liberty?Link作物）含有來源于微生物的Bar或Pat基因。這兩個基因編碼的草丁膦乙酰轉移酶（PAT）能夠催化乙酰輔酶A與草丁膦游離氨基結合，降解被植物吸收的草丁膦，從而消除草丁膦對谷氨酰胺合成酶抑制和植物氨代謝的干擾，賦予植物對草丁膦的耐性。Bar基因來自于潮濕鏈霉菌（S.?hygroscopicus），而pat基因則來自于綠色產色鏈霉菌（S.?Viridochromogenes）。盡管兩個基因來源不同，但它們很相似。耐草丁膦作物之所以能夠抗草丁膦是因為這種作物具有分解草丁膦的能力，也就是說，草丁膦在接觸谷氨酰胺合成酶之前就被草丁膦乙酰轉移酶分解掉。為了提高Bar（pat）基因在植物的表達，大多數生產上利用的基因都經過了密碼子偏愛改造，但是氨基酸序列沒有變化。雖然，小鼠喂毒試驗結果表明草丁膦乙酰轉移酶能在胃和腸道中徹底分解，在食用過程中不會出現潛在的危害。但是，由于該基因來源于微生物，而不是來源于農作物本身，不同程度上都會造成消費者的抵觸心理。

由于谷氨酰胺合成酶是草丁膦的靶標酶，盡管Bar能快速降解草丁膦，但是草丁膦在接觸谷氨酰胺合成酶之前很難徹底將其分解，因為很多谷氨酰胺合成酶分布在細胞膜上，因此草丁膦在轉Bar基因農作物上應用時，會不同程度地干擾植物的氮代謝，同時影響植物正常的生長和發育。目前抗草甘膦除草劑農作物的培育大多使用對除草劑不敏感的EPSPS基因。但是尚未見對草丁膦不敏感的谷氨酰胺合成酶基因及其商業應用的研究報道或專利，推測可能的原因是自然界缺乏草甘膦分解酶，而bar則對草丁膦具有很強的分解效果。植物中過量表達野生型谷氨酰胺合成酶只能部分緩解草丁膦傷害，如將豌豆來源的野生型GS基因轉化小麥，轉基因植株可以緩解草丁膦的傷害，但耐性程度不足以商業化應用。

發明內容

本發明的目的在于提供三個草丁膦抗性提高的水稻細胞質型谷氨酰胺合成酶突變基因及其制備方法，所述突變基因的核苷酸序列分別如SEQ?ID?No?1、SEQ?ID?No3、SEQ?ID?No?5所示；所述突變基因的氨基酸序列分別如SEQ?ID?No?2、SEQ?ID?No4、SEQ?ID?No?6所示；其對應的氨基酸突變位點分別為：G245S/G318V、N54S/S115F/G245S、V200A/T293A/R295K。這三個突變基因編碼的谷氨酰胺合成酶對草丁膦的抗性顯著增強。通過所述的突變基因在釀酒酵母中的表達和草丁膦耐受性的驗證，表明改組基因具有構建植物表達載體，獲得耐草丁膦植物的應用潛力。

為達到上述目的，本發明主要采用如下技術方案：