[發(fā)明專利]重組大腸桿菌、副雞禽桿菌抗原蛋白及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410207226.9
• 申請日: 2014-05-15
• 公開（公告）號: CN104371962A
• 公開（公告）日: 2015-02-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王宏俊;張培君;李淑芳;龔玉梅;李永清;李桂萍;趙成全
• 申請（專利權(quán)）人: 北京市農(nóng)林科學(xué)院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P21/02;A61K39/02;A61P31/04;C12R1/19
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于家禽傳染病疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種重組大腸桿菌、副雞禽桿菌抗原蛋白及其應(yīng)用。?

背景技術(shù)

副雞禽桿菌(Avibacterium?paragallinarum，Apg)為巴氏桿菌科的一種短小革蘭氏陰性桿菌，基本特征為無運動性、菌體呈多形性、強毒株帶有莢膜。1932年De?Blieck首先報道了自鼻道和鼻竇黏膜具有急性卡他性炎癥、面部水腫和結(jié)膜炎的雞群中首次分離出一種革蘭氏陰性桿菌。最初的研究報道指出該病原菌生長條件中既需要X(血紅素晶)因子，也需要V(煙酰胺腺嘌啉二核苷酸，NAD)因子，早期的研究者將其命名為雞嗜血桿菌(Haemophilus?gallinarum)。1962年，Page等人研究發(fā)現(xiàn)所有IC病例的分離株生長只需要V因子。因此，有學(xué)者提議將只需要V因子的雞嗜血桿菌命名為—個新種：副雞嗜血桿菌(H.paragallinarum)，并被廣泛接受。近年來，在南非、墨西哥等地已從患鼻炎的雞中分離到不依賴V因子的副雞嗜血桿菌菌株。因此，嚴格按照在體外生長因子需要進行嗜血菌的分類并不科學(xué)。2005年，Blackall等將副雞嗜血桿菌的名稱改為副雞禽桿菌(Avibacterium?paragallinarum)。?

副雞禽桿菌作為雞的一種重要的呼吸道病原菌，常引起雞的傳染性鼻炎(infectious?coryza,IC)，該病在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，給養(yǎng)雞業(yè)造成愈來愈嚴重的經(jīng)濟損失。目前國內(nèi)已有許多養(yǎng)雞場發(fā)生該病的報道。從感染部位來看，副雞禽桿菌感染的是呼吸系統(tǒng)中最前沿的部位--鼻道和鼻竇黏膜，可以說是呼吸道疾病的門戶病。這第一屏障被破壞，其他病原的感染率就大大增加。若與其它病原如雞傳染性支氣管炎病毒、雞支原體、雞傳染性喉氣管炎等并發(fā)感染后引起雞呼吸道疾病綜合征，會給養(yǎng)雞業(yè)造成更大的損失。各種日齡的雞都易感該菌，常見于13周齡以上的雞，通常表現(xiàn)為低死亡率和高發(fā)病率，?產(chǎn)蛋率下降10％～40％。該病病理變化主要表現(xiàn)在上呼吸道急性卡它性炎癥。典型癥狀是黏液性鼻竇炎，鼻竇黏膜水腫充血、黏膜桿狀細胞滲出，并且伴隨有異噬性白細胞和巨噬細胞，產(chǎn)生典型的鼻炎病變。臨床表現(xiàn)為面部單側(cè)或雙側(cè)腫脹、流鼻涕，食欲下降、產(chǎn)蛋率下降?？刂圃摬⊥ǔ?yīng)用抗生素結(jié)合綜合防治措施，鑒于Apg不同血清型之間缺乏交叉保護，所以在未確定流行的病原菌的血清型之前，常用二價或三價滅活菌苗來免疫預(yù)防。由于Apg含有脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)等毒素物質(zhì)，大量接種所帶來毒副作用也會影響雞的產(chǎn)蛋與生長。?

雞傳染性鼻炎是一種呼吸道傳染病，目前主要靠滅活疫苗來控制。滅活疫苗的免疫效果可能與所激發(fā)的黏膜抗體相關(guān)。研究表明A、B、C三個血清型的Apg均有不同程度的致病力，但三者的滅活菌體不存在型間交叉免疫，只存在型內(nèi)交叉免疫保護。目前國際上普遍使用的滅活疫苗絕大多數(shù)都包含了A型和C型，隨著國內(nèi)外陸續(xù)發(fā)現(xiàn)有大量B型Apg的流行和發(fā)生，國際上影響較大的疫苗公司已經(jīng)開始提供包含A、B、C三種血清型的三價滅活疫苗。雞傳染性鼻炎滅活疫苗對野外雞群感染的預(yù)防效果大約為70-80％，在其效力檢驗中由于環(huán)境和評價方法的不盡一致可能會有不同的結(jié)果。?

常規(guī)滅活菌苗在使用過程中遇到了難以突破的難題，在生產(chǎn)中已經(jīng)出現(xiàn)了型內(nèi)不能交叉保護的現(xiàn)象。津巴布韋和南非的研究報道中也發(fā)現(xiàn)了同樣的問題。這樣就使副雞禽桿菌滅活疫苗的使用陷入一個更為復(fù)雜的局面，即疫苗公司面臨著各地流行的變異株，需要研制出包含各種變異株的菌苗。另一方面，由于副雞禽桿菌含有LPS等毒素物質(zhì)，大量接種所帶來毒副作用也會影響雞的產(chǎn)蛋與生長，因此導(dǎo)致了生產(chǎn)上免疫失敗時有發(fā)生。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個目的是獲得一株能夠分泌副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白的重組大腸桿菌，利用該重組大腸桿菌獲得免疫原性更好的保護性抗原蛋白，利用該保護性抗原蛋白制備一種適用于預(yù)防或/和防治副雞禽桿菌的亞單?位疫苗。?

本發(fā)明的第二個目的在于將所制備的重組大腸桿菌在制備副雞禽桿菌亞單位疫苗中的應(yīng)用。?

為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，申請人通過制備獲得一株能夠分泌副雞禽桿菌免疫保護性抗原(編碼基因登錄號-FJ965542.1，其編碼基因序列如SEQ?No.1所示)的重組大腸桿菌(Escherichia?coil)BL21/pGEX-5X-1-18d，該菌株已于2014年3月5日送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC?No.8896。?