[發明專利]丙型肝炎病毒(HCV)細胞進入抑制肽ZTE2序列及應用

在審

• 申請號: 201410206248.3
• 申請日: 2014-05-16
• 公開（公告）號: CN104324361A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發明（設計）人: 譚文杰;張玲;盧莎;鄧瑤;陶格斯;劉曉明
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所
• 主分類號: A61K38/10
• 分類號: A61K38/10;A61P31/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域本發明屬于病毒分子生物學領域。涉及利用HCV包膜蛋白E2的多肽對HCV感染的防治。?

背景技術丙型肝炎病毒(HCV)為黃病毒屬，單股正鏈RNA病毒，全長基因組約有9600個核苷酸組成，形成單一的開放閱讀框，編碼一個約3000個氨基酸的單一多蛋白，在病毒自身編碼的蛋白酶及宿主編碼的信號肽酶的切割加工下，形成4個結構蛋白(Core，E1，E2，p7)和6個非結構蛋白(NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B)。HCV引發的丙型肝炎，急性感染者中約80％發展為慢性，其中約20％發展為肝纖維化和肝硬化，并可能進一步發展為肝癌。目前全球約有1.7億感染者，我國約有4000萬，HCV感染已經成為全球性的社會公共衛生問題之一。?

丙型肝炎病毒的高度變異性，給疫苗的研究造成了極大的困難。目前對HCV感染的治療從單一的聚乙二醇-干擾素(PEG-IFN)或者與利巴韋林(RBV)的聯合用藥外，直接靶向病毒的藥物(DAAs)及靶向宿主的抗病毒藥物(HTAs)陸續出現。美國FDA已經批準兩種抑制HCV復制的藥物，即直接靶向HCVNS3/4A蛋白酶的抑制劑，分別是Vertex公司的telaprevir及Merck公司的Boceprevir。另外靶向宿主的抗病毒藥物也相繼進入臨床II期試驗，包括靶向HCV進入宿主細胞受體SR-BI的抑制劑：ITX-5061等^[1]。雖然目前的治療效果較好，但是副作用大，價格昂貴，因此尋找防治HCV感染的有效靶點仍然需要眾多研究者共同努力。?

在病毒感染細胞的生物過程中，病毒與宿主細胞膜表面受體的特異性結合是病毒感染的最初環節，型別不同的同種病毒在與細胞結合過程中作用分子一般是固定的，如果能夠阻礙兩者之間的結合，即可以有效抑制病毒性感染的發生。2003年美國FDA批準抗人免疫缺陷病毒(HIV)的新藥T-20(Enfuvirtide)上市，T-20是穿入抑制劑中第一個上市的藥物，含有36aa，能夠與HIV包膜蛋白gp41結合，阻止病毒與靶細胞的融合，臨床試驗證明效果較好，受試者副反應較小^[2]。?

目前已經證明HCV的包膜糖蛋白E1E2是與宿主細胞受體結合的唯一關鍵分子，其中E2被認為是最重要的分子。1998年Pileri等的研究表明人CD81(hCD81)可能是HCV的受體，隨后低密度脂蛋白受體(LDLR)、清道夫受體B族I型(SR-BI)、鈣離子依賴型(C型)凝集素DC/L-SIGN、Occludin和細胞連接骨架蛋白Clauding-1等都被證實是HCV的可能受體，目前比較一致的看法為HCV是通過包膜糖蛋白E2與CD81特異性結合，使病毒吸附于靶細胞表面，但由于CD81介導的內吞作用弱，病毒最終進入細胞可能還需要其他分子，如LDLR、SR-BI等來輔助，Clauding-1則在病毒穿入過程的后期起到關鍵作用^[3-8]。?

我們通過分析HCV基因型2a的參考株JFH-1(GenBank?no.D95A86)包膜糖蛋白E1E2，人工合成覆蓋完整E1E2氨基酸序列的多肽126條，其中E1有37條，E2有89條，每條多肽由15aa組成，相鄰兩條多肽有10aa重疊。運用HCVcc(FLJclp7NS2Gluc2a)對以上合成的多肽進行篩選，研究發現位于包膜糖蛋白E2氨基酸序列692-710aa位置的兩條多肽E2-78，E2-79，在10nM的濃度下，對HCV感染的抑制率可以達到抑制80％左右，半數有效抑制濃度約為5nM。在研究多?肽與病毒作用關系的試驗中，多肽與病毒共孵育(0h)和感染后孵育(+4h)的情況下，與陰性對照(DMSO)相比，多肽的加入能夠明顯抑制HCV感染Huh7.5CD81細胞，具體表現為感染細胞中HCV特異性蛋白Core的表達量下降，病毒RNA的拷貝數下降，細胞培養上清中Gluc熒光素酶的活性下降。該實驗證明本次篩選獲得的兩條多肽，是通過阻止病毒進入細胞的生物過程而發揮作用的，具體是否是通過與病毒競爭性的結合靶細胞表面的受體的方式發揮抑制感染的效果，還需要深入研究。?

這一發現具有重要的意義，不僅可以幫助理解該新發病毒感染的過程和機制，也能為阻斷HCV感染，尤其是肝移植病人再感染的預防治療提供新的設計思路，希望能為研發理想的HCV預防/治療性候選藥物提供參考依據。?

發明內容：

本發明解決的問題在于提供抑制丙型肝炎病毒(HCV)的多肽ZTE2，篩選能與HCV包膜糖蛋白E2結合的多肽序列，獲得以HCV?E2為靶位的多肽，以阻斷病毒與細胞的結合，從而抑制病毒侵染細胞。?