[發明專利]谷子銹菌巢式PCR高效檢測方法

有效

• 申請號: 201410204620.7
• 申請日: 2014-05-15
• 公開（公告）號: CN103981265B
• 公開（公告）日: 2016-11-16
• 發明（設計）人: 李志勇;董志平;白輝;馬繼芳;王楠;董立;全建章;劉磊
• 申請（專利權）人: 董志平
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
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技術領域

本發明涉及用巢式PCR（nested?PCR）技術對谷子銹菌進行檢測，屬于植物真菌分子生物學檢測技術領域。

背景技術

谷子（Setaria?italica）起源于我國，是哺育中華民族的主要糧食作物之一，其種植面積和產量均居世界之首。小米營養豐富，隨著世界雜糧熱的興起，出口量在穩步增加，已經成為我國的特色創匯雜糧。谷草是牲畜的優質飼草，在耕地緊缺的情況下是發展畜牧養殖業的首選糧草兼用性作物。但是谷子病害的發生，嚴重影響著谷子的產量和質量。

谷銹?。?i>Uromyces?setariae-italicae）是世界谷子產區經常發生的一種氣傳流行性病害，嚴重影響著谷子的穩產和高產。谷子銹病病原菌Uromyces?setariae-italicae，屬擔子菌亞門（Basidiomycotina）、柄銹菌科（Pucciniaceae）、單胞銹屬（Uromyces）。谷子銹病在谷子的葉片和葉鞘上都可發生，但在葉片上發生更加嚴重。發病初期，在葉片表面與葉背面，特別是背面產生隆起的夏孢子堆，夏孢子堆成熟后突破寄主表皮而外露，增強了植株的蒸騰作用，使植株喪失大量水分，減少光合作用面積，一般減產10%-30%，嚴重時植株倒伏，造成絕產。

在谷子銹病發生的初期階段，由于潛伏侵染癥狀并不明顯，用傳統的病害癥狀、病原形態學等方法很難進行檢測，谷銹病為典型氣傳流行性病害，等癥狀明顯時已很難進行防控，因此初期診斷非常重要。同時谷銹菌存在許多其他寄主，如青狗尾草、莠狗尾草、倒刺狗尾草、谷莠子等。因此急需找到一種谷銹菌檢測方法，以便于對谷銹菌寄主范圍進行檢測，更加清楚了解其初侵染源。近年來，基于PCR原理的分子生物學技術的發展為植物體內病原菌的快速、準確診斷提供了有效的工具。在真核生物的核糖體DNA（rDNA）中，編碼區保守性較強而非編碼區具有較大的可變性，是進行真菌分類的有效序列。在非編碼區，相對于核糖體基因內轉錄間隔區(?rDNA-ITS)而言，rDNA基因間隔區IGS(?intergenic?spacer?)變異性更高，是真菌內進行種間比較的和分類的重要DNA片段。巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(PCR)，使用兩對PCR引物擴增完整的片段。第一對PCR引物擴增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物結合在第一次PCR產物內部，使得第二次PCR擴增片段短于第一次擴增。梁宏等根據小麥光腥黑穗病IGS區與小麥矮腥黑穗病菌及小麥網腥黑穗病菌的差異設計特異性引物，對小麥光腥黑穗病菌進行了分子檢測；王永強以中國不同地理來源的稻曲病菌菌株為材料，對其IGS序列進行了初步的比較分析，為稻曲病菌種下群體的鑒定奠定了基礎。本研究基于真菌rDNA-IGS區域，設計了檢測谷子銹菌的巢式PCR特異性引物，為快速、準確的檢測谷子銹菌提供了技術支持，能夠更早、更及時的發現病原菌，對谷子銹病的早期檢測和防治具有重要意義。

發明內容

本發明提供了一種利用巢式PCR技術檢測谷子中銹菌的方法，通過該方法可快速診斷出谷子植株中是否攜帶銹菌，具有特異性強、靈敏度高的特點，為銹病的早期診斷、科學預防和病情的控制提供了技術保障。

本發明的具體步驟是：

1、提取基因組DNA

采用CTAB法提取谷子銹菌、其它供試菌株以及接種銹菌的谷子葉片基因組DNA。以IGS通用引物擴增銹菌基因組DNA，其上游引物和下游引物堿基序列如序列表中SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示。PCR擴增獲得720bp的特異性片段，片段回收純化后與PMD19-T載體連接過夜，利用熱激法轉入大腸桿菌JM109感受態細胞中，通過菌落PCR法檢測陽性克隆，把陽性克隆送上海生工進行測序，測序分析后獲得谷銹菌IGS序列，其核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?No.3所示。

2、第一輪PCR擴增

以第1步提取的基因組DNA為模板，采用谷子銹菌IGS區外側特異性引物對Urs1-F/Urs1-R，經PCR擴增得到第一輪PCR擴增產物；

引物序列：SEQ?ID?No.4???Urs1-F：5'-GCCTCTAAGTCAGAATCCGTGC-3'；

SEQ?ID?No.5???Urs1-R：5'-GACGGGATGCGGTAAGTTCA-3'；