[發(fā)明專利]煙草根特異啟動(dòng)子NtR2及其在轉(zhuǎn)基因植物上的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410203765.5
• 申請(qǐng)日: 2014-05-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103966218A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳華;蔡鐵城;巫升鑫;潘淑芳;張沖;陳順輝;莊偉建
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種煙草根特異啟動(dòng)子NtR2及其在轉(zhuǎn)基因植物上的應(yīng)用，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

長(zhǎng)期以來(lái)煙草根部病害是影響煙草產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害，如煙草青枯病、根腐病等，煙草青枯病是毀滅性病害，病菌從根部侵入，煙草青枯病是我國(guó)南方和長(zhǎng)江流域的重要病害，屬細(xì)菌性病害，主要從根部侵入，很快導(dǎo)致植株枯萎死亡；由于尚無(wú)有效的防治藥劑，植物青枯病長(zhǎng)期以來(lái)一直未能解決，對(duì)煙草青枯病的防治至今沒(méi)有特效藥可治。

關(guān)于根部特異表達(dá)的啟動(dòng)子報(bào)道較少。Schneider K等利用T-DAN標(biāo)簽技術(shù)分離克隆了可在Arabidopsis根毛表皮細(xì)胞中特異表達(dá)的核蛋白基因；Xu Y等對(duì)編碼水稻根部特異表達(dá)蛋白的兩個(gè)cDNA克隆(RCc2和RCc3的特性進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白主要在幼根中表達(dá))。目前在煙草上已克隆出一些組織特異性的啟動(dòng)子，如種皮特異性啟動(dòng)子、花藥特異啟動(dòng)子TA29等(Fobert,1994; 李國(guó)勝等, 1995)。Yamamoio等人(1991)報(bào)道煙草根特異表達(dá)的TobRB7基因的cds片段5’上游1800bp區(qū)段中的片段，具根組織特異表達(dá)調(diào)控功能，但主要在煙草幼根中表達(dá)。

福建農(nóng)林大學(xué)油料所莊偉建等人（2010）報(bào)道煙草根特異啟動(dòng)子NtR12，在煙草根部表達(dá)，表達(dá)量大大超過(guò)對(duì)照Pbi121載體，莖部也微量表達(dá)，目前尚未見(jiàn)將煙草組織特異表達(dá)啟動(dòng)子應(yīng)用于轉(zhuǎn)外源目的基因的報(bào)道。

由于煙草是四倍體，遺傳背景及其復(fù)雜，選育良好的栽培種非常困難，而目前主要栽培的品種經(jīng)過(guò)多年栽培，已經(jīng)容易產(chǎn)生根部病蟲害。植物基因組學(xué)與功能基因組學(xué)的快速發(fā)展，通過(guò)分子育種來(lái)解決以往常規(guī)育種沒(méi)有辦法解決的科學(xué)難題已經(jīng)成為了可能。定向的分子育種首先要考慮到啟動(dòng)子，不同類型的啟動(dòng)子給植物生長(zhǎng)也帶來(lái)不同的影響，隨著轉(zhuǎn)基因安全性得到了普遍關(guān)注，因此選擇有效的啟動(dòng)子成為了當(dāng)前分子安全育種的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種煙草根特異啟動(dòng)子NtR2及其在轉(zhuǎn)基因植物上的應(yīng)用，利用特異啟動(dòng)子來(lái)安全有效的解決煙草生產(chǎn)過(guò)程中的根部病蟲害。

本發(fā)明的煙草根特異啟動(dòng)子，其至少含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

克隆該煙草根特異啟動(dòng)子的方法，是利用基因芯片進(jìn)行了煙草各器官RNA差異雜交和表達(dá)譜分析，從中又篩選分離了高效根特異表達(dá)基因，RT-PCR鑒定特異基因的時(shí)空表達(dá)，克隆全長(zhǎng)基因序列，進(jìn)而克隆上游特異啟動(dòng)子；所述全長(zhǎng)基因序列的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

具體地說(shuō)，是利用基因芯片進(jìn)行了煙草各器官RNA差異雜交和表達(dá)譜分析，從中又篩選分離了高效根特異表達(dá)基因，對(duì)篩選得到的根特異表達(dá)基因進(jìn)行鑒定，并克隆得到了全長(zhǎng)特異基因，進(jìn)而克隆特異基因上游的啟動(dòng)子，構(gòu)建特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因的植物表達(dá)載體，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)將目的啟動(dòng)子導(dǎo)入本生煙草上，對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行GUS組織化學(xué)鑒定，確定了煙草啟動(dòng)子的特異性。具體如下：

1、利用基因芯片進(jìn)行了煙草各器官RNA差異雜交和表達(dá)譜分析，從中又篩選分離了高效根特異表達(dá)基因;

2、煙草特異啟動(dòng)子NtR2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示;

3、構(gòu)建的植物表達(dá)載體為pBI121- NtR2::GUS；所述的pBI121- NtR2::GUS指以NtR2為啟動(dòng)子，GUS為報(bào)告基因，Nos為終止子，Kam為篩選轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的植物表達(dá)載體;

4、 通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，獲得轉(zhuǎn)基因煙草陽(yáng)性植株，通過(guò)GUS染色，證實(shí)了煙草啟動(dòng)子NtR12的特異性。

根據(jù)上述培育方法，已經(jīng)成功獲得轉(zhuǎn)pBI121- NtR2::GUS載體的轉(zhuǎn)基因煙草，通過(guò)與35S組合型啟動(dòng)子進(jìn)行對(duì)比鑒定，在根部的表達(dá)量高于35S，而在轉(zhuǎn)基因煙草莖部、葉片不表達(dá)，證實(shí)了煙草NtR2啟動(dòng)子的特異性，為煙草轉(zhuǎn)基因安全育種提供了有利的前景。

本發(fā)明利用基因芯片進(jìn)行了煙草各器官RNA差異雜交和表達(dá)譜分析，從中又篩選分離了高效根特異表達(dá)基因，克隆得到煙草根特異啟動(dòng)子NtR2，并利用特異啟動(dòng)子構(gòu)建植物表達(dá)載體，建立以抗生素為篩選劑的轉(zhuǎn)基因遺傳體系，以及快速、高效的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)，確定了煙草根部特異啟動(dòng)子的遺傳表達(dá)，為分子育種煙草抗根部病害品種的培育奠定了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。