[發明專利]一種新型、廣譜的治療性腫瘤疫苗的制備和使用方法

有效

• 申請號: 201410201724.2
• 申請日: 2014-05-13
• 公開（公告）號: CN103933558A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發明（設計）人: 曾鋼
• 申請（專利權）人: 無錫伊琳生物技術有限公司
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;A61K48/00;A61P35/00;C12N15/867;C12N5/10;C12N5/0784
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所(普通合伙) 11130
• 代理人: 孟旭;王為

1.一種治療性腫瘤疫苗，由一種轉基因腫瘤細胞系和DC細胞共同培養后制備得到；其中，所述轉基因腫瘤細胞系是用逆轉錄病毒對腫瘤細胞進行轉染得到的，具有在細胞內表達GM-CSF分子和/或在細胞表面表達NY-ESO-1分子的能力；所述在細胞內表達GM-CSF分子的能力通過病毒或者DNA質粒介導獲得；所述在細胞表面表達NY-ESO-1分子的能力通過病毒或者DNA質粒介導獲得；所述腫瘤細胞是從患者身上獲得的活的腫瘤細胞，所述轉染是將含有逆轉錄病毒的質粒和Phoenix細胞混合，其中加入DNA轉染試劑得到含有逆轉錄病毒的Phoenix細胞上清液；然后再用該細胞上清液和腫瘤細胞混合培養得到轉染逆轉錄病毒的腫瘤細胞；轉染逆轉錄病毒的腫瘤細胞經過培養擴增，然后利用表面表達的NY－ESO－1分子進行流式細胞儀介導的腫瘤細胞純化，對純化后的細胞進行GM－CSF轉染，得到可表達GM－CSF的純化的轉染逆轉錄病毒的腫瘤細胞系；所述制備是將所得可表達GM－CSF的純化的轉染逆轉錄病毒的腫瘤細胞進行滅活，得到滅活的可表達GM－CSF的純化的轉染逆轉錄病毒的腫瘤細胞；將該滅活的腫瘤細胞和DC細胞共同培養，得到細胞混合物，再經提取分離即得。

2.如權利要求1所述的腫瘤疫苗，其特征在于：所述的腫瘤細胞表達GM-CSF分子。

3.如權利要求1所述的腫瘤疫苗，其特征在于：所述的腫瘤細胞表面表達NY-ESO-1分子。

4.如權利要求1所述的腫瘤疫苗，其特征在于：所述的腫瘤細胞同時表達GM-CSF分子和表面NY-ESO-1分子。

5.如權利要求1所述的腫瘤疫苗，在制備轉基因腫瘤細胞過程中，其特征在于：腫瘤細胞來源于病人本身的腫瘤體外培養細胞，異體的腫瘤培養細胞系，或者多個異體腫瘤培養細胞系混合。

6.如權利要求1所述的腫瘤疫苗，其特征在于實體瘤或者液體腫瘤可以通過病毒，或者DNA質粒介導達到表達GM-CSF和表面NY－ESO－1的作用。

7.如權利要求1所述的腫瘤疫苗，其特征在于腫瘤細胞包括胰腺癌，肺癌，胃癌，腎癌，前列腺癌，乳腺癌，肝癌，結腸癌，鼻咽癌，頭頸癌。

8.如權利要求1所述的腫瘤疫苗，其特征在于疫苗制備過程需要通過細胞分選以達到90％以上的細胞表面NY－ESO－1表達效率。

9.權利要求1所述的腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于，步驟如下：

1)使用Phoenix細胞系統產生逆轉錄病毒:首先，在六孔板中進行轉染，將2微克編碼人類GM-CSF或表面NY-ESO-1分子的逆轉錄病毒DNA質粒加入1-2x10⁶Phoenix細胞系統，同時加入DNA轉染試劑LipofectamineLTX?and?PLUSReagents，轉染24小時以后，收集懸浮細胞進行下一步操作；

2)使用逆轉錄病毒轉染腫瘤細胞：在一個六孔板中，1x10⁶腫瘤細胞將被放在0.5mL逆轉錄病毒懸液和0.5mL濃度為4微克/mL的聚凝胺中懸浮培養；

3)純化擴增轉染的腫瘤細胞：以上基因工程轉染的細胞能夠通過流式細胞儀對抗癌基因抗體熒光染色的活細胞進一步分選，達到大于90％的純度，之后，對分選出的細胞進行進一步擴增；

4)多次GM－CSF轉染：在以上純化的腫瘤細胞到達5x10⁶以后，進行多次GM－CSF病毒轉染，同時檢測細胞上清液，保證二十四小時內每百萬個腫瘤細胞分泌GM－CSF到達3ng/ml以上；

5)滅活制備腫瘤疫苗：細胞系做成單細胞懸液經過300Gy的輻照儀照射，得到滅活細胞；

6)上述滅活細胞和DC細胞用細胞培養液共同培養，得到混合細胞懸液。

7)對混合細胞懸液進行純化，分離，配制，制備成疫苗制劑。

10.權利要求1所述的腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于，步驟如下：

1)首先，將1mL編碼人類表面NY-ESO-1分子的逆轉錄病毒DNA質粒加入1-2x10⁶Phoenix細胞系統，同時加入DNA轉染試劑LipofectamineLTX?and?PLUSReagents。轉染24小時，收集懸浮細胞進行下一步操作，

2)復蘇一支腫瘤細胞系，將其放入6孔板中，僅使用一孔，接種腫瘤細胞數量為1－1.5×10⁶cells。放入培養箱中培養，

3)等腫瘤細胞飽和度為50％-70％時，將0.5mL逆轉錄病毒懸液和0.5mL新鮮培養液加入腫瘤細胞中進行培養，培養16小時以后，換新鮮培養液，并保持細胞快速生成，不要滿壁，

4)等將近90％滿壁時，將轉染NY-ESO-1的腫瘤細胞移入培養瓶中進行擴增培養，細胞轉瓶過程中使用EDTA對貼壁腫瘤細胞進行消化，腫瘤細胞培養約5－10天，細胞數量生長到5×10⁷-1×10⁸，

5)用c-Myc對表面表達NY-ESO-1的活腫瘤細胞進行特異性標記，進行流式分選，使表達NY-ESO-1的腫瘤細胞純度大于90％，細胞收集率為5％-15％，

6)對分選出的細胞進行進一步擴增，培養5－10天，細胞數量達到1×10⁸cells，

7)在六孔板中接種1－1.5×10⁶cells純化擴增后的NY-ESO-1腫瘤細胞，其余細胞進行液氮保存，

8)將1mL編碼人類表面GM-CSF分子的逆轉錄病毒DNA質粒加入1-2x10⁶Phoenix細胞系統，同時加入DNA轉染試劑LipofectamineLTX?and?PLUSReagents，轉染24小時，收集懸浮細胞進行下一步操作，

9)將0.5mL逆轉錄病毒懸液和0.5mL濃度為4微克/mL的聚凝胺加入腫瘤細胞中進行培養，添加前細胞一定處于快速生長期，且只有50％左右confluency，培養12小時，

10)用GM-CSF的ELISA試劑盒檢測細胞上清液，最終保證二十四小時內每百萬個腫瘤細胞分泌GM－CSF到達10ng/ml以上，

11)將上述細胞制成單細胞懸液，對其進行300Gy的輻照儀處理，得到滅活細胞。該滅活細胞可以單獨使用，視腫瘤種類做皮下，靜脈，或者淋巴節注射，

12)采集患者外周血，對外周血進行分離，得到外周血單個核細胞，并制成DC，

13)將滅活腫瘤細胞與DC進行共同培養，培養1天，

14)第2天，DC細胞經具體途徑視腫瘤種類而定，回輸給患者。