[發(fā)明專利]一種用于檢測腐敗酵母菌核苷酸片段的引物、探針及檢測方法和試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410201044.0
• 申請日: 2014-05-13
• 公開（公告）號: CN104109711A
• 公開（公告）日: 2014-10-22
• 發(fā)明（設計）人: 肖性龍;萬松華;余以剛;吳暉;李曉鳳;胡雙芳
• 申請（專利權(quán)）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/72;C12R1/84;C12R1/865;C12R1/645
• 代理公司: 廣州市華學知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 宮愛鵬

1.一種用于檢測腐敗酵母菌核苷酸片段的引物，其特征在于，所述的引物由上游引物Yeast?F1和下游引物Fungus?R1組成，所述的上游引物Yeast?F1的堿基序列為GAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAA，下游引物Fungus?R1的堿基序列為TCCTTCCCTTTCAACAATTTCAC。

2.一種用于檢測腐敗酵母菌核苷酸片段的探針，其特征在于，所述探針的堿基序列為TGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCC。

3.一種腐敗酵母菌核苷酸片段的檢測試劑盒，其特征在于，包括以下組分：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于，包括以下組分：

5.一種腐敗酵母菌核苷酸片段的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)按照權(quán)利要求1和2的序列設計引物和探針；

(2)按照DNA提取試劑盒提取待測樣品中酵母基因組DNA作為模板；

(3)建立反應體系

利用上述引物和探針進行反應體系的建立，確定采用的熒光PCR反應體系，以20μl體系計，所需各組分及相應濃度如下：

(4)選擇儀器的檢測通道

在進行熒光PCR反應時，應對所用儀器中反應管熒光信號的收集進行設置，選擇的熒光檢測通道與探針所標記的熒光報告基團一致；

(5)上機檢測

將上述20μl的反應體系進行熒光PCR檢測；經(jīng)檢測，若待測樣品中含有腐敗酵母則顯示陽性擴增曲線；若待檢培養(yǎng)液中不含有酵母菌則無擴增信號。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于，所述PCR條件選擇如下：95℃1min，1個循環(huán)；

95℃5sec，60℃40sec，40個循環(huán)。

7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的檢測方法，其特征在于，所述熒光PCR反應體系如下，以20μl體系計：

8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的檢測方法，其特征在于，所述腐敗酵母菌為假絲酵母屬(Candida)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、地絲菌屬(Geotrichum)、薔薇酵母屬(Rhodotorula)、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)、德克/酒香酵母(Dekkera/Brettanomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或異常畢赤酵母(Wickerhamomyces(Pichia)anomala)。

9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的檢測方法，其特征在于，所述腐敗酵母菌為釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)、近平滑假絲酵母(Candida?parapsilosis)、斯巴達畢赤酵母(Pichia?Sparta)、漢遜德巴利酵母(Debaryomyces?hansenii)或淺紅酵母(Rhodotorula?pallida?Lodder)。