[發明專利]鼠李糖誘導型啟動子及其應用

有效

• 申請號: 201410200910.4
• 申請日: 2014-05-13
• 公開（公告）號: CN104651357B
• 公開（公告）日: 2017-06-16
• 發明（設計）人: 劉波;張偉;張宇宏;徐欣欣;張宇微
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 北京思元知識產權代理事務所(普通合伙)11598
• 代理人: 余光軍

技術領域

本發明涉及啟動子，尤其涉及一種從畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115中分離鑒定的鼠李糖誘導型啟動子，本發明還涉及含有該鼠李糖誘導型啟動子的重組真核表達載體及重組宿主細胞，本發明進一步涉及該誘導型啟動子在調控外源基因在真核細胞中進行適時、適量表達等方面的應用，屬于鼠李糖誘導型啟動子的分離及應用領域。

背景技術

畢赤酵母表達系統以高密度發酵、發酵工藝成熟、發酵成本低、產物易分離等優點而廣泛用于外源蛋白的表達(Macauley-Patrick等人，2005，Yeast，22:249-270；Damasceno等人，2012，Applied Microbiology and Biotechnology，93:31-39)。畢赤酵母利用甲醇作為唯一的碳源和能量來源時，甲醇誘導表達甲醇代謝所需的酶類如醇氧化酶(Alcohol Oxidase,AOX)的含量可達到胞內蛋白的30％(韓雪清等人，2003，微生物學雜志，23：35-40)，因此AOX1啟動子(P_AOX1)是一個適用于外源基因高效表達的調控因子，基于P_AOX1的畢赤酵母表達載體得以廣泛應用。但使用這類表達系統時會存在以下兩方面問題：1)在實驗室小規模發酵時，涉及到繁瑣的培養基置換的過程；2)在誘導表達蛋白特別是在大規模發酵時，涉及大量甲醇存放、使用等過程，因而存在較大的風險。另外，基于畢赤酵母組成型強啟動子—三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子(P_GAP)的表達載體也得以廣泛應用，但這類表達系統也存在以下弊端：1)在組成型啟動子的調控下，目的蛋白在整個發酵期間持續表達，因此難以實現外源蛋白表達的精確控制；2)當所表達的蛋白對宿主細胞的生長有副作用時，難以實現目的蛋白的表達。

研究表明，鼠李糖可誘導與鼠李糖代謝相關酶類的表達，并且多個鼠李糖誘導型啟動子被分離并應用于外源基因的表達(Cardona等人，2006，Appl Environ Microbiol，72：2547-2555；Fieseler等人，2012，PLoSOne，7；Wegerer等人，2008，BMC Biotechnol，14)。真核生物中，鼠李糖代謝的初始步驟中主要涉及如下四種酶：L-鼠李糖脫氫酶(L-rhamnose1-dehydrogenase)、內酯酶(lactonase)、脫水酶(dehydratase)、醛縮酶(aldolase)。研究表明，木糖發酵酵母(Scheffersomyces stipitis)中與鼠李糖代謝相關酶基因形成基因簇，并且相關基因表達受鼠李糖特異性誘導(Koivistoinen等人，2012，Gene，492:177-185)。畢赤酵母亦可利用鼠李糖為唯一碳源和能源，然而在畢赤酵母GS115染色體上僅有PAS_chr1-4_0075位點被注釋為L-鼠李糖脫水酶編碼基因，其它三個基因未被確定。

因此，從畢赤酵母GS115染色體上鑒定分離一種鼠李糖誘導型啟動子進而構建基于該鼠李糖誘導型啟動子的真核表達載體，不僅可避免使用危險物甲醇，還可通過控制誘導物的添加量和添加時間來調控目的蛋白適時、適量地表達，在外源基因適度表達和基礎研究方面也將具有重要的應用價值。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種從畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115中分離的鼠李糖誘導型啟動子。

本發明的目的之二是提供一種含有上述鼠李糖誘導型啟動子的重組真核表達載體及含有該表達載體的重組宿主細胞。

本發明的目的之三是將所述的鼠李糖誘導型啟動子以及含有該鼠李糖誘導型啟動子的重組真核表達載體應用于外源基因適度表達和基礎研究等方面。

本發明首先提供了一種從畢赤酵母GS115中分離鑒定的鼠李糖誘導型啟動子，其多核苷酸序列為(a)、(b)、(c)或(d)所示：

(a)、SEQ ID NO.1所示的多核苷酸序列；或

(b)、與SEQ ID NO.1的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的多核苷酸，該多核苷酸仍具有鼠李糖誘導型啟動子的功能；或