[發(fā)明專利]一種丁香假單胞菌及其篩選方法和在殺滅線蟲中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410199803.4
• 申請(qǐng)日: 2014-05-13
• 公開（公告）號(hào): CN104031859B
• 公開（公告）日: 2017-04-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李林;秦旭;孫孝文;顧桐;張震
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12Q1/04;A01N63/02;A01P5/00;C12R1/38
• 代理公司: 武漢凌達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所(特殊普通合伙)42221
• 代理人: 宋國(guó)榮

1.一種丁香假單胞菌在殺滅線蟲中的應(yīng)用，其特征在于，丁香假單胞菌分類命名為丁香假單胞菌MB03(Pseudomonas syringae MB03)，保藏日期為：2014年4月2日，保藏單位為：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)，保藏中心保藏編號(hào)：CCTCC NO:M 2014114；所述丁香假單胞菌MB03形態(tài)及生理生化特征包括：在LB固體培養(yǎng)基上菌落突起，呈乳白色，菌體鏡檢呈桿狀，為革蘭氏陰性菌；應(yīng)用方法是：以丁香假單胞菌MB03的發(fā)酵上清液，和/或細(xì)胞破碎液，和/或丁香假單胞菌MB03經(jīng)硫酸銨沉淀后的胞外粗蛋白和/或胞內(nèi)粗蛋白對(duì)秀麗隱桿線蟲和南方根結(jié)線蟲進(jìn)行殺滅。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丁香假單胞菌在殺滅線蟲中的應(yīng)用，其特征在于，丁香假單胞菌MB03菌體制備方法是：將丁香假單胞菌MB03菌種劃線接種到LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為12h；然后從上述固體培養(yǎng)基中挑取單菌落丁香假單胞菌MB03菌種裝入有5mL的LB液體培養(yǎng)基的PA瓶中經(jīng)28℃，160r·min^-1培養(yǎng)10h；然后將丁香假單胞菌擴(kuò)大培養(yǎng)，就是將上述PA瓶中活化的丁香假單胞菌MB03菌種按體積比1％的接種量轉(zhuǎn)接到裝有200mL的LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行28℃，160r·min^-1擴(kuò)大培養(yǎng)24h；然后以12000r·min^-1離心3min，沉淀即為丁香假單胞菌MB03菌體，后將丁香假單胞菌MB03菌體用PBS緩沖液洗滌四遍之后，用PBS緩沖液懸浮成為用于殺滅線蟲的菌體懸液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丁香假單胞菌在殺滅線蟲中的應(yīng)用，其特征在于，丁香假單胞菌MB03菌體細(xì)胞破碎液的制備方法是：將丁香假單胞菌MB03菌體用PBS洗滌四遍之后所得的懸浮菌體再進(jìn)行壓力破碎后，再以12000r·min^-1，4℃離心15min，上清液即為細(xì)胞破碎液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丁香假單胞菌在殺滅線蟲中的應(yīng)用，其特征在于，丁香假單胞菌MB03胞外粗蛋白的制備方法是：對(duì)丁香假單胞菌MB03菌體制備過程中的發(fā)酵上清液中的蛋白進(jìn)行硫酸銨沉淀，再經(jīng)過透析除鹽，最后得到用于殺滅線蟲的丁香假單胞菌MB03胞外粗蛋白，還用作實(shí)驗(yàn)生測(cè)所需的菌體樣品；對(duì)發(fā)酵上清液中的蛋白進(jìn)行硫酸銨沉淀時(shí)，向發(fā)酵上清液中投入硫酸銨的量為發(fā)酵上清液重量的0.05％～100％；向丁香假單胞菌MB03菌體制備過程中的發(fā)酵上清液中投入硫酸銨的量分為5級(jí)：第1級(jí)為0.05％～50％，第2級(jí)為50％～60％，第3級(jí)為60％～70％，第4級(jí)為70％～80％,第5級(jí)為80％～100％，分別得到5種不同的丁香假單胞菌MB03胞外粗蛋白。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丁香假單胞菌在殺滅線蟲中的應(yīng)用，其特征在于，丁香假單胞菌MB03胞內(nèi)粗蛋白的制備方法是：對(duì)細(xì)胞破碎液中的蛋白進(jìn)行硫酸銨沉淀，再經(jīng)過透析除鹽，最后得到用于殺滅線蟲的丁香假單胞菌MB03胞內(nèi)粗蛋白；對(duì)細(xì)胞破碎液中的蛋白進(jìn)行硫酸銨沉淀時(shí)，向細(xì)胞破碎液中投入硫酸銨的量為細(xì)胞破碎液重量的0.05％～100％。

6.一種丁香假單胞菌作為線蟲防治的資源和機(jī)制研究的應(yīng)用，其特征在于，丁香假單胞菌分類命名為丁香假單胞菌MB03(Pseudomonas syringae MB03)，保藏日期為：2014年4月2日，保藏單位為：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)，保藏中心保藏編號(hào)：CCTCC NO:M 2014114，形態(tài)及生理生化特征包括：在LB固體培養(yǎng)基上菌落突起，呈乳白色，菌體鏡檢呈桿狀，為革蘭氏陰性菌；以殺滅秀麗隱桿線蟲和南方根結(jié)線蟲的因子丁香假單胞菌MB03胞外粗蛋白和胞內(nèi)粗蛋白用于分子基因操作。