[發(fā)明專利]一種同步檢測四種蘋果病毒的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410196186.2
• 申請日: 2014-05-12
• 公開（公告）號: CN103966362A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王亞南;曹克強(qiáng);趙緒生
• 申請（專利權(quán)）人: 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/94
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種同步檢測四種蘋果病毒的方法，其特征在于通過提取蘋果組織總RNA，采用四種病毒及一種蘋果內(nèi)源基因的特異性引物，通過多重RT-PCR方法擴(kuò)增各病毒及蘋果內(nèi)源基因特異性序列，凝膠電泳觀察擴(kuò)增產(chǎn)物大小，判定組織中所帶病毒種類。

2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步驟：

（1） 蘋果組織總RNA的提取 田間樣本采取帶有葉芽一年生枝條頂端0~5cm皮層組織，組培苗采取葉片組織，采用Trizol法提取組織總RNA，定容于30 μL 除RNase水中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）病毒特異性基因序列的擴(kuò)增以步驟（1）獲得的總RNA為模板，進(jìn)行多重RT-PCR得到擴(kuò)增產(chǎn)物。引物為：第1對引物：ASPV-F：5’-T G G A A C C T C A T G C T G C A-3’；ASPV-R：5’-T T G G G A T C A A C T T T A C T A A A A A G C A T A A-3’。第2對引物：ASGV-F：5’- G A G G A T T T A G G T C C C T C T C-3’；ASGV-R：5’-G T A T A A A G G C A G G C A T G T C A A C C-3’。第3對引物：ApMV-F：5’-C A A C C G A G A G G T T G G C A-3’；ApMV-R：5’-T T C T A G C A G G TC T T C A T C G A-3’。第4對引物：ACLSV-F：5’-G A G A G T T T C A G T T T G C T A G A C A-3’；ACLSV-R：5’-G C A A A T T C A G T C T G T A A A A G-3’。第5對蘋果內(nèi)源基因引物：EF1-α-F：5’-A C C A A C C T T G A C T G G T A C A A G G-3’；EF1-α-R：5’-T G G T G C A T C T C A A C A G A C T-3’。

（3）瓊脂糖凝膠電泳檢測 取8μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用含0.5μg.ml^-1溴化乙錠的2％瓊脂糖凝膠在1×TAE緩沖液中進(jìn)行電泳分析，120V電泳40分鐘，根據(jù)電泳條帶大小判斷病毒種類。

3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于四種蘋果病毒特異性片段大小為：蘋果莖痘病毒（Apple stem pitting virus，ASPV）360 bp、蘋果莖溝病毒（Apple stem grooving virus，ASGV）821 bp、蘋果花葉病毒（Apple mosaic virus，ApMV）161 bp、蘋果褪綠葉斑病毒（Apple chlorotic leafspot virus，ACLSV）566 bp，蘋果內(nèi)源基因 EF1-α特異性片段大小為236 bp。