[發明專利]芒果橫線尾夜蛾tubulin基因轉錄水平熒光定量PCR檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201410195730.1
• 申請日: 2014-05-09
• 公開（公告）號: CN103952490A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發明（設計）人: 魏輝;鄭麗禎;田厚軍;陳藝欣;林碩;常虹
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明涉及一種芒果橫線尾夜蛾微管蛋白（tubulin）基因轉錄水平的熒光定量PCR檢測試劑盒，屬于分子生物學檢測技術中的熒光定量DNA體外擴增技術領域。

背景技術

聚合酶鏈式反應(Polymerase?Chain?Reaction,?PCR)，即DNA體外擴增技術，PCR技術將模板DNA、特異引物、dNTPs底物、耐熱DNA聚合酶等放在同一個緩沖反應體系中，進行反復高溫變性、低溫退火、中溫鏈延伸的熱循環，實現靶DNA片段在反應液中呈2ⁿ倍擴增（其中n為熱循環次數）。

熒光定量PCR是一種核酸定量技術，該技術在PCR反應系統中引入了特定的熒光標記物質，通過檢測每個熱循環后PCR反應體系中的熒光值的變化情況來實時監測DNA的擴增情況，并獲得每個樣本的熒光定量變化曲線，從而獲得每個反應管的Ct值（熒光變化達到閾值時的循環數），以起始模板數的對數為橫坐標，以Ct值為縱坐標制備標準曲線，據此標準曲線和各個標本的Ct值對每個反應的起始DNA模板數進行定量測定。

SYBR?Green是一種結合于雙鏈DNA小溝中的結合染料。與雙鏈DNA結合后，其熒光大大增強，這種性質用于擴增產物的檢測非常理想。在PCR反應體系中，加入過量SYBR?Green?I熒光染料，當該染料摻入DNA雙鏈后，熒光信號增強；當DNA變性時SYBR?Green?I染料釋放出來，熒光急劇減少；隨后在聚合延伸過程中引物退火并形成PCR產物，SYBR?Green?I染料與雙鏈產物結合，經檢測獲得熒光的凈增量。熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。這種高靈敏度、較低毒性的核酸染料在結合雙鏈DNA分子后熒光增強800-1000倍。

????SYBR?Green在核酸的實時檢測方面有很多優點，由于它與所有的雙鏈DNA相結合，不必因為模板不同而特別定制，因此設計的程序通用性好，且價格相對較低。此外，由于一個PCR產物可以與多分子的染料結合，因此SYBR?Green的靈敏度很高。但是，由于SYBR?Green與所有的雙鏈DNA結合，因此由引物二聚體、單鏈二級結構以及錯誤的擴增產物引起的假陽性會影響定量的精確性。通過測量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產物的影響。由解鏈曲線來分析產物的均一性有助于分析由SYBR?Green得到定量結果的準確性。

????在熒光定量PCR檢測基因表達水平時，經常檢測某個基因的相對表達量，其中內參基因常常選擇tubulin。通過大量的實驗研究，我們優化出了一套能夠有效檢測芒果橫線尾夜蛾tubulin基因表達量的引物和PCR反應條件，并組裝成tubulin基因表達檢測熒光定量聚合酶鏈式反應試劑盒，以滿足生命科學、植物保護研究者的檢測需要。

發明內容

????本發明的目的是提供了一種芒果橫線尾夜蛾tubulin基因轉錄水平熒光定量PCR檢測試劑盒，解決了現有技術中檢測不靈敏，成本高等問題。

本發明的技術方案如下：

一種芒果橫線尾夜蛾tubulin基因轉錄水平熒光定量PCR檢測引物，引物序列為：正向引物1：5＇-?TTGATGAGGTCCGCACTGGC?-3＇；

反向引物2：5＇-?GATTTCCTTGCCGATGGTGTAG?-3＇。

2、一種芒果橫線尾夜蛾tubulin基因轉錄水平熒光定量PCR檢測試劑盒，試劑盒由SYBR?Premix?Ex?Taq^TM、引物混合物、標準tubulin基因模板和超純水組成，試劑盒中各組成成分如下：

SYBR?Premix?Ex?Taq^TM購自TaKaRa公司：包含Ex?TaqHS，dNTP?Mixture，Mg²⁺，Tli?RNaseH，SYBRGreen?I?；?

引物混合物：正向引物1為10?μmol/L、反向引物2為10?μmol/L；

標準tubulin基因模板：濃度為1.0?μmol/L，tubulin基因模板序列如SEQ?ID?NO:3所示；

超純水組成：純度不超過18.30?MΩ·CM。

本發明具有以下有益效果：

1.?本發明實現了方便快捷的檢測tubulin基因轉錄水平的目的。

2.?本發明在檢測基因轉錄水平方面具有靈敏度高、穩定性好、實驗成本低的優點。

附圖說明