[發(fā)明專利]人乳頭瘤病毒8E7蛋白表達(dá)及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410194991.1
• 申請(qǐng)日: 2014-05-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104059934A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-09-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程浩;陳賢禎;韓睿;朱可建;周強(qiáng);丁楊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C07K16/08
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

1.人乳頭瘤病毒8E7蛋白表達(dá)及純化方法，其特征在于，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)：

（1）HPV-8E7基因的調(diào)取及擴(kuò)增：設(shè)計(jì)HPV-8E7的擴(kuò)增引物，并從HPV-8E7質(zhì)粒中有效擴(kuò)增出這個(gè)基因，其中用于擴(kuò)增用于原核表達(dá)的HPV-8E7序列的上游引物序列SEQ ID NO.1：5’-GGATCCATGATTGGTAAAGAGGTCACTGT-3’，劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物序列SEQ ID NO.2：5’-GAATTCTTATGATCCGCCATGTTTGCA-3’，劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn)；

用于擴(kuò)增用于真核表達(dá)的HPV-8E7序列的上游引物序列SEQ ID NO.3：5’- GAATTCTATGATTGGTAAAGAGGTCACTGT-3’， 劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物序列SEQ ID NO.4：5’-GGATCCTTATGATCCGCCATGTTTGCA-3’，劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)；

（2）HPV-8E7基因原核及真核表達(dá)載體的構(gòu)建：將步驟（1）中得到的這兩個(gè)含不同酶切位點(diǎn)的HPV-8E7基因序列按照先后順序插入到載體pGEX-4T2和pEGFP-C1中，獲得用于后續(xù)同源重組的重組載體pGEX-4T2-(HPV-8E7)和pEGFP-C1-(HPV-8E7)；

（3）GST-(HPV-8E7)融合蛋白的原核表達(dá)：將步驟（2）中構(gòu)建的重組載體pGEX-4T2-(HPV-8E7)轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α，優(yōu)化IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度；

在250-300w超聲功率下，超聲時(shí)間9秒，間歇時(shí)間9秒，總時(shí)長(zhǎng)約3分鐘以破碎細(xì)菌，收集上清；

（4）GST-(HPV-8E7)融合蛋白的純化及HPV-8E7蛋白的獲得：通過(guò)（3）步驟獲得的上清與Glutathione-Sepharose 4B磁珠結(jié)合，再用凝血酶切除GST標(biāo)簽，獲取HPV-8E7蛋白，PBS透析過(guò)夜獲得純化的HPV-8E7蛋白。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人乳頭瘤病毒8E7蛋白表達(dá)純化方法，其特征在于，在設(shè)計(jì)蛋白表達(dá)載體時(shí)，選擇含GST標(biāo)簽的pGEX-4T2，且在蛋白純化后，可將GST標(biāo)簽切除，使獲得的蛋白更接近天然HPV-8E7蛋白，在誘導(dǎo)蛋白表達(dá)時(shí)為避免形成不可溶的包涵體，采取降低IPTG的濃度，縮短誘導(dǎo)時(shí)間，降低誘導(dǎo)溫度。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人乳頭瘤病毒8E7蛋白表達(dá)純化方法，其特征在于，步驟(1)、(2)、(3)中，大腸埃希菌宿主DH5α、真核表達(dá)載體pEGFP-C1購(gòu)于大連寶生物TaKaRa，原核表達(dá)載體pGEX-4T2從GE health care公司購(gòu)得，HPV-8型E7質(zhì)粒來(lái)源于德國(guó)癌癥研究中心應(yīng)用病毒研究所。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法獲得的人乳頭瘤病毒8E7蛋白在制備多克隆抗體中的應(yīng)用。