[發明專利]通過發酵過量生產γ-谷氨酰半胱氨酸和該二肽的衍生物的微生物和方法

無效

• 申請號: 201410191775.1
• 申請日: 2014-05-07
• 公開（公告）號: CN104164381A
• 公開（公告）日: 2014-11-26
• 發明（設計）人: 馬塞爾·托恩;托馬斯·施勒澤爾
• 申請（專利權）人: 瓦克化學股份公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P21/02;C12R1/19;C12R1/01
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 余剛;張英

技術領域

本發明涉及適于過量生產γ-谷氨酰半胱氨酸(γGC)和該二肽的衍生物γ-谷氨酰胱氨酸和雙-γ-谷氨酰胱氨酸的原核微生物菌株，以及用于制備這些化合物的方法。?

背景技術

γ-谷氨酰半胱氨酸是通過連接氨基酸L-半胱氨酸和L-谷氨酸而形成于原核和真核生物細胞中的二肽。?

雙-γ-谷氨酰胱氨酸是通過兩分子的γ-谷氨酰半胱氨酸的氧化形成的二硫化物。該反應是可逆的，這意味著，通過還原(例如酶法或化學法)，雙-γ-谷氨酰胱氨酸可以轉化回γ-谷氨酰半胱氨酸。?

γ-谷氨酰胱氨酸是通過一分子的γ-谷氨酸半胱氨酸和一分子的L-半胱氨酸的氧化形成的二硫化物。該反應是可逆的，這意味著，通過還原(例如化學法)，γ-谷氨酰胱氨酸可以轉化回γ-谷氨酰半胱氨酸和L-半胱氨酸。?

巰基化合物γ-谷氨酰半胱氨酸在很多生物中作為谷胱甘肽的前體。谷胱甘肽生物合成的第一步是通過ATP-依賴性酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶連接L-半胱氨酸的α-氨基和L-谷氨酸的γ-羧基之間的γ-肽鍵。此外，由于酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶被谷胱甘肽抑制，該反應是谷胱甘肽生物合成的限速步驟。谷胱甘肽生物合成的第二步是L-甘氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸反應以產生谷胱甘肽，其中L-甘氨酸通過α-肽鍵和γ-谷氨酰半胱氨酸的半胱氨酰官能團連接。該ATP-依賴性的反應也同樣由酶谷胱甘肽合成酶催化。?

由于其抗氧化的特性，谷胱甘肽在細胞中起關鍵作用，并且作為還原劑、輔底物、輔因子參與很多細胞過程。然而，也已知存在谷胱甘肽缺陷的生物，其中所述谷胱甘肽前體γ-谷氨酰半胱氨酸發揮谷胱甘肽的生物學?作用。已知的實例是諸如鹽生鹽桿菌(Halobacterium?halobium)(Sundquist?and?Fahey,1989,J.Biol.Chem.264:719-725)的典型嗜鹽古細菌。?

此外，在文獻中描述了各種菌種的不同谷胱甘肽缺陷微生物菌株，如釀酒酵母(Grant?et?al.,1997,Mol.Biol.Cell.8:1699-1707)、集胞藻(Synechocystis?sp.)(Cameron?and?Pakrasi，2011,Plant?Signal.Behav.6:89-92)或大腸桿菌(Fuchs?and?Warner,1975,J.Bacteriol.124:140-148)。這些菌株在相應的編碼谷胱甘肽合成酶的基因中具有突變或缺失(例如，大腸桿菌和集胞藻的gshB或者啤酒酵母的gsh2)。通過谷胱甘肽合成酶活性的改變或缺失，這些菌株不再能或僅能在一定程度上合成谷胱甘肽。因此細胞γ-谷氨酰半胱氨酸水平提高。由于增強的形成和提高的濃度的現存γ-谷氨酰半胱氨酸承擔了很多谷胱甘肽特異性功能，這些突變菌株是有生存能力的。然而，相比對應的野生型菌株，這些菌株的特征在于對活性氧和重金屬離子的增加的敏感度，使得其生長部分被損害(Cameron?and?Pakrasi,2011Plant?Signal.Behav.6:89-92；Helbig?et?al.,2008,J.Bacteriol.190:5439-5454)。?

活性氧、重金屬離子和外源化合物(xenobiotic)的解毒頻繁發生在許多生物中，也在人類中，尤其通過谷胱甘肽的方式(Grant?et?al.,Mol.Biol.Cell.8:1699-1707)。此外，較低的谷胱甘肽水平通常是諸如自閉癥、帕金森病、囊性纖維病、HIV、癌癥或精神分裂癥的各種疾病的癥狀和/或基礎(Wu?et?al.,2004,J.Nutr.134:489-492)。因此，對維持恒定的細胞內谷胱甘肽水平甚至提高其水平存在相當大的關注。γ-谷氨酰半胱氨酸已被成功測試作為用于提高細胞谷胱甘肽水平的有前景的物質(Anderson?and?Meister,1983,P.N.A.S.80:707-711)。?

WO2006102722描述了用于制備γ-谷氨酰半胱氨酸的酶促法，這是基于半胱氨酸衍生物和γ-谷氨酰半胱氨酸供體的反應，通過固定的γ-谷氨酰半胱氨酸轉肽酶。?