[發(fā)明專利]具有增強(qiáng)子作用的家蠶BmHel-8轉(zhuǎn)座子

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410190464.3
• 申請(qǐng)日: 2014-05-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103923891A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-07-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張澤;韓民錦
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 重慶大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/12
• 分類號(hào): C12N9/12;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及的生物技術(shù)領(lǐng)域，主要是家蠶轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器和品種改良領(lǐng)域。

背景技術(shù)

滾環(huán)式轉(zhuǎn)座子(Helitron)最初是在模式生物擬南芥，水稻和線蟲(chóng)基因組中被發(fā)現(xiàn)并且被歸類為DNA類轉(zhuǎn)座子(Kapitonov?and?Jurka2001)。但是Helitron轉(zhuǎn)座子的序列結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)座機(jī)制都與其它DNA類轉(zhuǎn)座子完全不同。在轉(zhuǎn)座機(jī)制上，由于完整的Helitron轉(zhuǎn)座子編碼的轉(zhuǎn)座酶包含復(fù)制起始(Rep)和解螺旋酶(Helicase)的保守基序,所以它們被認(rèn)為是以滾環(huán)式機(jī)制進(jìn)行轉(zhuǎn)座的并且偏向于插入到基因組的AT二核苷酸內(nèi)。在序列結(jié)構(gòu)上，它們的5’端是以TC二核苷酸起始，3’端是以CTRR(R代表A或G)四個(gè)核苷酸終止,并且在其3’端通常具有一個(gè)頸環(huán)結(jié)構(gòu)(Mendiola?et?al.1994)。

近年許多研究表明Helitron轉(zhuǎn)座子廣泛的發(fā)布于高等真核生物基因組內(nèi)，例如在線蟲(chóng)中有超過(guò)2％，青蛙中超過(guò)0.5％，蝙蝠中大約3％，玉米中大約2％和果蠅中1-5％的基因組序列是由Helitron轉(zhuǎn)座子組成(Kapitonov?and?Jurka2001,Kapitonov2006,Pritham?and?Feschotte2007,Du?et?al.2009,Yang?and?Bennetzen2009)。雖然Helitron轉(zhuǎn)座子在許多真核生物中被報(bào)道，但是Helitron轉(zhuǎn)座子在鱗翅目昆蟲(chóng)基因組中卻尚未報(bào)道。最近，我們用基于結(jié)構(gòu)和同源性搜索相結(jié)合的方法對(duì)家蠶的全基因組Helitron轉(zhuǎn)座子進(jìn)行了鑒定和注釋，結(jié)果發(fā)現(xiàn)家蠶基因組中具有21個(gè)Helitron轉(zhuǎn)座子家族(被命名為BmHel-1到BmHel-21)，約占整個(gè)家族基因組序列的4.23％。

雖然近年許多物種的Helitron轉(zhuǎn)座子相繼被報(bào)道，但是對(duì)于Helitron轉(zhuǎn)座子的研究還仍停留在全基因組鑒定上。真核生物基因組中為什么會(huì)保留如此多的Helitron轉(zhuǎn)座子序列？究竟具有什么功能？仍鮮有報(bào)道。最近我們應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)家蠶的BmHel-8具有顯著地增加其下游基因表達(dá)的功能。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是利用生物信息學(xué)，分子和細(xì)胞生物學(xué)方法在家蠶中鑒定并證實(shí)了家蠶BmHel-8轉(zhuǎn)座子起到了增強(qiáng)子的作用。目的在于將該元件構(gòu)建到表達(dá)載體或者轉(zhuǎn)基因載體中可以有效增加目的基因表達(dá)的效果。

本發(fā)明申請(qǐng)人利用生物信息學(xué)方法在家蠶基因組中鑒定了一個(gè)Helitron轉(zhuǎn)座子BmHel-8。應(yīng)用PCR和TA克隆的方法在家蠶基因組中獲得了該轉(zhuǎn)座子的序列。測(cè)序驗(yàn)證為我們的目的序列。然后將該轉(zhuǎn)座子分別連接到細(xì)胞轉(zhuǎn)染載體pGL3-Basic?Vector載體的報(bào)告基因的5’端，再將這兩個(gè)載體分別進(jìn)行家蠶的細(xì)胞(BmN)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)了BmHel-8轉(zhuǎn)座子具有增強(qiáng)子的作用。

這不但有助于原核或真核表達(dá)獲取高豐度的目的蛋白而且對(duì)家蠶生物反應(yīng)器的發(fā)展也將起到推動(dòng)作用。

本發(fā)明的家蠶增強(qiáng)子BmHel-8通過(guò)以下步驟獲得和證實(shí)：

(1)家蠶BmHel-8轉(zhuǎn)座子的鑒定：首先應(yīng)用基于結(jié)構(gòu)和同源性搜索相結(jié)合的方法在家蠶9倍基因組序列中進(jìn)行Helitron轉(zhuǎn)座子序列的搜索。結(jié)果在家蠶基因組中鑒定出BmHel-8轉(zhuǎn)座子。該轉(zhuǎn)座子的一致序列(consensus?sequence)長(zhǎng)度421bp，5’端以ATC三核苷酸起始，3’端以CTAGT五個(gè)核苷酸終止。進(jìn)一步以BmHel-8的一致序列作為問(wèn)詢序列，用BLASTN程序在家蠶9倍基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋BmHel-8的同源序列(e值<e^-6,相似度>80％,序列長(zhǎng)度>80bp)，最終發(fā)現(xiàn)BmHel-8轉(zhuǎn)座子家蠶基因組中具有14656個(gè)拷貝。

(2)家蠶BmHel-8轉(zhuǎn)座子序列的獲得：以家蠶大造品系的基因組DNA為模板，BmHel-8轉(zhuǎn)座子的核苷酸序列設(shè)計(jì)特異性引物(上游引物為：5'-GGTACCATCTATATATTAATACGTGAAGCA-3'；下游引物為：5'-CTCGAGACTAGAGGTCCCGCAGTAG-3'下劃線分別為限制性內(nèi)切酶KpnI和XhoI酶切位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取目的條帶，PCR產(chǎn)物回收后與PMD-19-T載體連接轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽(yáng)性克隆后送往上海生工生物工程公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增的序列與預(yù)期的結(jié)果一致。

(3)將目的片段構(gòu)建到細(xì)胞轉(zhuǎn)染載體