[發明專利]一種用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法

有效

• 申請號: 201410190312.3
• 申請日: 2014-05-07
• 公開（公告）號: CN103924003B
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 謝紅衛;錢明娟;蔡耀輝;顏滿蓮;毛凌華;李永輝;聶元元;顏龍安
• 申請（專利權）人: 江西省超級水稻研究發展中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙)11371
• 代理人: 吳開磊

技術領域

本發明涉及水稻利用領域，具體而言，涉及一種用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法。

背景技術

由于線粒體基因組的重組，導致植物線粒體基因組的序列具有很大的差異，比較分析任何兩個植物物種(甚至是同源物種)的線粒體基因組的基因間區發現，大部分基因間區都不是保守的。因此，植物線粒體基因組存在各自特異的序列(Mitochondrial-specific sequences，簡稱MS)。

例如，將小麥Ks3和Km3的線粒體基因組進行比較，只有85.2％的序列為保守序列，Ks3包含11.38％的Km3所沒有的特異序列，與NCBI數據庫比較，7.3％Ks3序列為新序列，其中大部分特異序列位于進化速率快的基因間區。再如，比較Sugar beet TK81-MS和TK81-O線粒體基因組，發現，TK81-MS存在68kb TK81-O沒有的MS，類核、類葉綠體、類線粒體-episome的MSS分別占7.6％、17.9％、0.1％和4.6％，其余為未知來源。

目前，水稻已測序完成了4個線粒體基因組，分別是水稻品種Nipponbare、9311、CW和LD。其中，Nipponbare是一個典型的粳稻品種，9311為典型的秈稻品種；CW細胞質來源于中國普通野生稻W1(Oryza rufipogon)；LD細胞質來源于秈稻品種緬甸的Lead水稻。水稻線粒體基因組最大的為CW(559,045bp)，而LD只有434,745bp，同線性分析表明，Nipponbare和9311較為保守，而CW和LD與其他兩個已測序的水稻線粒體基因組在序列組成及排列上差異都很大，即水稻線粒體基因組也存在大量的特異序列(MS)。

由于不同的水稻種的線粒體基因組存在較大的差異，因此，對于其親緣關系以及進化分析可采用相應的細胞質分子鑒定的方法。

在相關技術中，對水稻而言，一般采用RFLP分子標記研究其進化分析、親緣關系；然而RFLP分子標記需要進行酶切、凝膠電泳、轉膜以及放射性標記的探針雜交等一系列的操作，整個操作繁瑣復雜、費時耗力。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法，以解決上述的問題。

在本發明的實施例中提供了一種用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法，包括以下步驟：

分析比對CW、Lead、Nipponbare和9311的線粒體基因組，篩選出不保守的MS序列；

根據所述MS序列設計相應的分子標記PCR引物；

提取不同品種的水稻的總DNA；

以所述總DNA作為模板，以所述分子標記PCR引物作為引物進行PCR擴增，獲得擴增產物；

對所述擴增產物進行電泳檢測，篩選出能夠導致擴增差異的多態性引物，并獲得利用該多態性引物擴增得到的目的條帶；

對利用所述多態性引物擴增獲得的目標條帶進行統計，建立聚類圖，以進行親緣關系分析。

本發明的實施例中提供的用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法，其通過分析比對4個已知水稻的線粒體基因組序列，篩選出了不保守的MS序列(多個)，然后再根據所述MS序列設計相應的分子標記PCR引物，每個MS序列對應設置一對分子標記PCR引物。然后再以不同品種的水稻的總DNA為模板，以所述分子標記PCR引物作為引物進行PCR擴增，獲得擴增產物；將擴增產物進行電泳檢測，并篩選出能夠導致擴增差異的多態性引物(對于每一種引物，如果一部分水稻種類能擴增出帶，而另外一部分水稻種類不能擴增出帶，則該引物為多態性引物)以及該多態性引物擴增得到的目的條帶；再對利用所述多態性引物擴增獲得的目標條帶進行統計，建立聚類圖，以進行親緣關系分析，進而獲得不同種類水稻的進化關系。

與現有技術中常見的RFLP分子標記相比，本發明提供的這種用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法，其操作簡便，所需設備也簡單，只需要PCR儀、臺式離心機以及凝膠電泳設備以及相應的分析軟件即可完成整個鑒定操作，常規的分子實驗室可完成整個實驗操作，因此，克服了現有技術中RFLP分子標記操作繁瑣復雜、費時耗力的缺陷。

另外，由于在水稻線粒體的MS位置區序列，其不易再發生線粒體基因組重組，因此，在本發明的實施例中，在利用所述MS序列設計相應的分子標記PCR引物以及后續一系列操作開發的本的分子標記，其結果可靠穩定。