[發明專利]一種檢測氣溶膠中牛病毒性腹瀉病毒的方法

有效

• 申請號: 201410188351.X
• 申請日: 2014-05-06
• 公開（公告）號: CN103981285A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 何洪彬;侯佩莉
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院奶牛研究中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 彭成

技術領域

本發明涉及一種檢測氣溶膠中牛病毒性腹瀉病毒的方法，屬于生物技術領域。

背景技術

牛病毒性腹瀉(Bovineviraldiarrhea，BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovineviral?diarrheavirus，BVDV)引起的傳染病，呈地方性流行。本病可通過接觸及氣溶膠等方式傳播，病牛及隱性感染牛的呼吸道、眼分泌物、乳汁及糞便等排泄物均含有病毒，在封閉式牛群中可呈暴發式流行，給畜牧業生產和相關商業領域造成巨大的經濟損失。

BVDV是單股正鏈RNA病毒，有囊膜，基因組由5’端非翻譯區(5’NTR)，一個長的開放閱讀框，編碼病毒的結構蛋白，包括病毒的衣殼蛋白和囊膜蛋白(Erns、E1和E2)和非結構蛋白，和3’端非翻譯區(3’NTR)組成。根據BVDV基因組5’端非翻譯區(5’NTR)序列不同，把BVDV分為牛病毒性腹瀉病毒I型(BVDV-1)和牛病毒性腹瀉病毒II型(BVDV-2)。BVDV流行株的基因分型在流行病學研究、疫苗研制乃至疫病的控制和消滅等方面都具有重要的意義。

實時熒光定量RT-PCR技術巧妙地利用了PCR技術的DNA高效擴增、熒光技術高特異性和光譜技術的敏感性及實時定量分析的優點，儀器自動分析，效率高、無后續處理，克服了常規PCR定性檢測的一些不足，極大地提高了檢測的敏感性和特異性，縮短了實驗時間、簡化了實驗操作。

氣溶膠是由懸浮于氣體介質中的固態或液態微小粒子形成的相對穩定的分散體系，其粒徑一般為0.001-100μm。空氣生物氣溶膠研究主要集中在動物舍環境氣載細菌、真菌及其毒素、內毒素等的檢測，而病毒氣溶膠濃度低、難以收集，樣品處理以及病毒的鑒定等方面比其他微生物的研究方法及步驟更加復雜，影響因素多，對病毒氣溶膠的研究不夠深人。迄今為止，還沒有應用SYBRGreenⅠ實時熒光定量RT-PCR技術檢測鑒別牛病毒性腹瀉病毒氣溶膠樣品的研究報道。本研究應用熒光RT-PCR對收集到的奶牛場不同環境中空氣樣品中牛病毒性腹瀉病毒進行檢測，操作簡便、快速，特異性強，靈敏度高，結果可靠。

發明內容

針對上述現有技術，一種檢測氣溶膠中牛病毒性腹瀉病毒的方法，可同時對氣溶膠樣本中牛病毒性腹瀉病毒不同基因型進行鑒別診斷。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種檢測氣溶膠中牛病毒性腹瀉病毒的方法，步驟如下：

(1)采集氣溶膠樣本；

進一步地，采集氣溶膠樣本的方法為：采用國際標準的全玻璃液體沖擊式采樣器(all-glass-impinger，簡稱AGI)，以10mLpH值7.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)為采樣介質，按照12.5L/min的采樣流量采集20min，收集養殖場環境中的氣溶膠樣本；

(2)提取氣溶膠樣本中病毒的RNA和cDNA；

進一步地，提取RNA和cDNA的方法為：將采集到的10mL氣溶膠樣本在4℃下12000r/min離心30min，取上清液1mL，應用病毒RNA試劑盒(商業化產品，現有技術中的常規試劑盒)提取病毒的總RNA；將RNA提取物溶解于50μLRNAase-free水中，按照FermentasRevertAid^TMFirstStrandcDNASynthesisKit說明書進行RT-PCR反應，得到cDNA；

(3)檢測：以上述提取的cDNA為模板，采用試劑盒進行SYBRGreenⅠ實時熒光定量PCR，具體如下：

所述試劑盒由特異性引物、牛病毒性腹瀉病毒陽性質粒pEASY-T3-B1、SYBRGreenⅠ實時熒光定量PCR試劑(現有技術中已有的常規試劑)和ddH₂O組成；所述的SYBRGreenⅠ實時熒光定量RT-PCR試劑盒為PremixExTaq^TMII(TliRNaseHPlus)試劑盒(購自大連寶生物)。采用SYBRGreenⅠ熒光染料的方法，要比Taqman探針方法簡便，價格相對較低。

所述牛病毒性腹瀉病毒陽性質粒pEASY-T3-B1由序列為SEQIDNO.9所示的DNA片段與pEASY-T3載體相連接后得到的重組質粒，連接方法為所屬領域常規技術。

所述特異性引物選自①通用檢測引物對或/和②牛病毒性腹瀉病毒I型、牛病毒性腹瀉病毒Ⅱ型鑒別檢測引物對；

所述通用型檢測引物對的序列如下：