[發明專利]一種嗜熱棲熱菌漆酶及工程菌、重組漆酶和應用

有效

• 申請號: 201410188145.9
• 申請日: 2014-05-06
• 公開（公告）號: CN104004721B
• 公開（公告）日: 2017-02-01
• 發明（設計）人: 林影;劉慧平;梁書利;韓雙艷;鄭穗平
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/81;C12N1/19;C02F3/00;C12R1/84
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司44245
• 代理人: 宮愛鵬

1.一種嗜熱棲熱菌漆酶，其特征在于，其氨基酸序列如Seq?No.2所示。

2.編碼權利要求1所述漆酶的DNA，其特征在于，序列如Seq?No.1所示。

3.權利要求2所述DNA在構建巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris)表達系統中的應用。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，將權利要求2所述DNA及其調節基因構成的表達盒整合到畢赤酵母的基因組中。

5.根據權利要求3或4所述的應用，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將權利要求2所述DNA連入到巴斯德畢赤酵母表達載體pHKFA1，得到表達載體pHKFA1-lacTT；

(2)通過將表達載體pHKFA1-lacTT化學轉化E.coli?Top10得到克隆菌株E.coli?Top10/pHKFA1-lacTT。

6.一種重組畢赤酵母工程菌，其特征在于，將權利要求5所述表達載體pHKFA1-lacTT線性化后轉化畢赤酵母(Pichia?pastoris)獲得。

7.根據權利要求6所述重組畢赤酵母工程菌，其特征在于，其構建方法如下：

將表達載體pHKFA1-lacTT經Kpn2I單酶切線性化并純化后電轉化畢赤酵母工程菌(Pichia?pastoris)GS115感受態細胞，并在MD平板進行陽性轉化子篩選；以MD平板篩選得到的轉化子為模板，以TTF和TTR為引物進行PCR鑒定，PCR鑒定正確的轉化子為重組畢赤酵母工程菌Pichia?pastoris?GS115/pHKFA1-lacTT，其中TTF和TTR的序列如Seq?No.3、4所示。

8.一種重組漆酶，其特征在于，將權利要求6或7所述重組畢赤酵母工程菌進行發酵獲得。

9.根據權利要求8所述的重組漆酶，其特征在于，其構建方法如下：

挑取重組畢赤酵母工程菌接種到BMGY培養基，30℃，250rpm培養至OD₆₀₀接近6.0，于6000rpm,4℃離心5min收集細胞，然后將收集的細胞重懸到BMMY培養基至起始OD₆₀₀接近1.0，于30℃，250rpm震蕩培養，每天補加終濃度1％甲醇；發酵六天后在6000rpm，4℃離心5min回收發酵上清液；用親和層析方法對發酵上清液的重組漆酶進行純化即可；所述BMMY培養基中含有0.1mM?CuSO₄。

10.權利要求8或9所述重組漆酶在染料脫色中的應用。