[發明專利]一種青藏高原藏羊mtDNA Cytb全序列合成方法

在審

• 申請號: 201410187687.4
• 申請日: 2014-05-06
• 公開（公告）號: CN103952421A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發明（設計）人: 劉建斌;孫曉萍;王凡;曾玉峰;郭健;岳耀敬;楊博輝;張萬龍;郎俠;馮瑞林;郭婷婷;牛春娥;王宏博
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/10
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種青藏高原藏羊mtDNA??Cytb全序列合成方法，其特征是，包括以下步驟：

（1）綿羊mtDNA??Cytb?全序列的收集與分析：

收集綿羊mtDNA??Cytb全序列，并與近緣種的mtDNA??Cytb全序列進行比對，分析mtDNA??Cytb全序列在近緣種的mtDNA全基因組序列上的相對位置；

（2）引物設計與PCR擴增：

根據mtDNA??Cytb基因在近緣種全基因組序列保守區域設計上、下游PCR引物，采用PCR方法擴增相鄰的兩個已知序列的未知序列，其中，PCR引物和測序引物1對，其引物序列為：

Forward??primer：5’-TGAAGAAAACCCCACAAAACCT?-3’

Reverse??primer：5’-TTGGGTGTTGATAGTGGGGC-3’；

（3）?PCR產物測序與序列組裝：

通過PCR產物測序反應體系對PCR產物進行測序、序列分析，將mtDNA??Cytb序列進行組裝，獲得mtDNA??Cytb全序列。

2.根據權利要求1所述的一種青藏高原藏羊mtDNA??Cytb全序列合成方法，其特征是，步驟（1）中，所述綿羊mtDNA??Cytb全序列的獲得方法有三種：一種是從測序獲得的基因組文庫或轉錄組文庫中查找；另一種是從GenBank數據庫中公開的綿羊基因序列中查找；第三種是通過收集近緣種的mtDNA??Cytb全序列進行同源比對，在保守區設計簡并引物，然后以藏羊的DNA為模板進行PCR擴增，測序后獲得青藏高原15個藏羊地方品種642個個體mtDNA??Cytb全序列。

3.根據權利要求1所述的一種青藏高原藏羊mtDNA??Cytb全序列合成方法，其特征是，步驟（1）中，所述近緣種為盤羊、東方盤羊和歐洲摩弗倫羊。

4.根據權利要求1所述的一種青藏高原藏羊mtDNA??Cytb全序列合成方法，其特征是，步驟（2）中，所述PCR方法中PCR擴增反應體系為30uL，包括基因組DNA模板2?uL、10×Buffer?3?uL、2.5?mM?dNTP?2?uL、Taq?DNA聚合酶0.2?uL、3?pM上下游引物各3?uL、滅菌雙蒸水16.8?uL；PCR反應程序為：94℃預變性5分鐘、94℃變性30秒、56℃退火30秒、72℃延伸90秒、36個循環、72℃延伸10分鐘；最后12℃保存。

5.根據權利要求1所述的一種青藏高原藏羊mtDNA??Cytb全序列合成方法，其特征是，步驟（3）中，所述PCR產物測序反應體系為5?uL，包括基因組DNA模板（30-50?ng）3?uL、3?pM測序引物1?uL、Bigdye?0.5?uL、滅菌雙蒸水0.5?uL；PCR測序反應程序為：95℃預變性120秒、95℃變性10秒、51℃退火10秒、60℃延伸190秒、25個循環、12℃保存。

6.根據權利要求1所述的一種青藏高原藏羊mtDNA??Cytb全序列合成方法，其特征是，步驟（3）中，所述PCR產物的測序方法為雙向、直接測序。

7.根據權利要求1或2或3所述的一種青藏高原藏羊mtDNA??Cytb全序列合成方法，其特征是，步驟（3）中，所述mtDNA??Cytb序列組裝方法是：以盤羊、東方盤羊和歐洲摩弗倫羊的mtDNA??Cytb全序列為參照物，將所有15個藏羊地方品種642個個體的mtDNA??Cytb序列進行拼接，獲得青藏高原藏羊mtDNA??Cytb全序列。

8.根據權利要求1所述的一種青藏高原藏羊mtDNA??Cytb全序列合成方法，其特征是，所述青藏高原藏羊mtDNA??Cytb全序列長度均為1140bp。