[發(fā)明專利]一種肺癌預后預測miRNA檢測試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410186710.8
• 申請日: 2014-05-06
• 公開（公告）號: CN105087758A
• 公開（公告）日: 2015-11-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳建華;張禮斌
• 申請（專利權(quán)）人: 陳建華
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)用診斷技術(shù)領(lǐng)域，涉及肺癌的預后領(lǐng)域，主要是肺癌化療后死亡危險度的預測，特別是涉及用于肺癌診斷的一組外周血miRNA的檢測方法和應用。

背景技術(shù)

肺癌是全世界范圍內(nèi)腫瘤死亡的首要原因，在中國，肺癌的發(fā)病率逐年升高，死亡率也是位居腫瘤死亡首位。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計，截至2025年，我國每年肺癌死亡病例將達到100萬(JemalA，BrayF，CenterMM，etal.Globalcancerstatistics.CACancerJClin，2011，61(2)：69-90；SheJ，YangP，HongQ，etal.LungcancerinChina：challengesandinterventions.Chest，2013，143(4)：1117-1126.)。近年來，盡管肺癌的診斷和臨床治療已取得很大進展，但患者的總生存時間仍很短，5年生存率不超過15％。目前的治療手段對肺癌總生存率的提高效果不大，II-IV期肺癌患者5年生存率大約在40％-5％之間，而I期患者5年生存率可高達92％。

基于外周血的分子標志物篩選是多年來腫瘤早期診斷研究的熱點，因為血液檢測微創(chuàng)，成本相對較低，可重復性高。其中，血清microRNA(miRNA)作為腫瘤標志物是目前最有吸引力的分子標志物。因為血清miRNA容易分離，并且非常穩(wěn)定，即便是在苛刻的條件下，如反復凍融和pH值改變等環(huán)境下也不容易降解。miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度為19-25個核苷酸的非編碼小分子RNA。它主要通過與靶標基因3′UTR的完全或不完全配對，降解靶標基因mRNA或抑制其翻譯，從而參與調(diào)控個體發(fā)育、細胞凋亡、增殖及分化等生命活動，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著類似于癌基因或抑癌基因的功能。

目前已經(jīng)證實，miRNA在組織和細胞中的表達表現(xiàn)為顯著的腫瘤相關(guān)性、組織特異性和表達穩(wěn)定性(LuJ，GetzG，etal.MicroRNAexpressionprofilesclassifyhumancancers.Nature.2005，435(7043)：834-838；ChoWC.Oncomirs：thediscoveryandprogressofmicroRNAsincancers.MolCancer.2007，6：60)。并且miRNA在外周血中的表達同樣具有腫瘤相關(guān)性和組織特異性，同時與RNA比較，其表達穩(wěn)定性更為顯著。研究表明通過檢測血漿或血清中的miRNA以診斷疾病是可行的、穩(wěn)定的及具有可重復性的。因此，有必要也有可能尋找血循環(huán)中的特異的腫瘤標志物，以期建立一種無創(chuàng)、快速、穩(wěn)定且經(jīng)濟的肺癌診斷方法。

發(fā)明內(nèi)容

目前腫瘤標志物和其他無創(chuàng)的篩選手段存在靈敏度低、特異性差以及對儀器設(shè)備要求較高的問題，為了解決這一問題，本發(fā)明的目的是選取肺癌特異性的miRNAs作為腫瘤標志物。本發(fā)明的目的是提供一種檢測外周血miRNA表達水平的熒光定量PCR試劑盒及使用方法，該試劑盒適用于目前市場上存在的各種類型的熒光定量基因擴增儀，定量快速準確、靈敏度高、穩(wěn)定性好、具有良好的應用前景。

本發(fā)明的另一目的是提供了一種熒光定量PCR試劑盒，其通過檢測肺癌病人外周血中miRNA的水平對肺癌預后預測進行快速的檢測。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過收集首診患者并且術(shù)前未接受輔助化療，術(shù)后輔助化療的病人進行跟蹤檢測，對不同肺癌患者和正常人外周血樣品，進行全基因組miRNA差異表達分析，發(fā)現(xiàn)及驗證不同肺癌外周血特異性miRNA，檢測候選miRNA表達譜在這些樣本中的表達，統(tǒng)計分析藥物治療前后miRNA的改變與預后關(guān)系的相關(guān)性，將篩選出的特異的miRNAs用于在肺癌高危人群中早期肺癌診斷及病人預后預測。

本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-141-3p在術(shù)后輔助化療的病人中有明顯的表達量變化，其表達量與病人的預后呈正相關(guān)關(guān)系。將hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-141-3p作為肺癌篩查的分子標志物具有非常重要的應用價值。前期研究表明hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-141-3p的表達水平高低與病人的預后具有明顯的依賴關(guān)系。作用于肺癌的治療后的復發(fā)、轉(zhuǎn)移及預后預測具有非常重要的臨床意義。

該組生物標志物還可以應用于肺癌的診斷。

此外，本發(fā)明還提供了一種利用上述生物標志物進行肺癌預后預測的方法，具有包括以下步驟：

(1)收集人外周血樣本；

(2)提取血清中總RNA；