[發明專利]一種活動精子DNA的拉曼光譜的快速測量方法

有效

• 申請號: 201410185856.0
• 申請日: 2014-05-05
• 公開（公告）號: CN103940802A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發明（設計）人: 黃祖芳;陳榮;陳冠楠;林居強;馮尚源;陳希文
• 申請（專利權）人: 福建師范大學
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65
• 代理公司: 福州君誠知識產權代理有限公司 35211
• 代理人: 戴雨君

技術領域

?本發明涉及一種活動精子DNA的基于拉曼光譜快速測量方法。

背景技術

近年來，不孕不育患者呈逐年增多的趨勢。世界衛生組織統計，全球約10～15%的夫婦遇到不孕不育的問題。中國已婚人群中，不孕不育比例達7%～10%，呈現快速上升的趨勢。其中，由于男性因素導致的不孕不育所占比例將近40%。臨床上，精液常規檢查主要是利用計算機輔助評估、分析精液中精子的濃度，活力，及形態等參數（通常稱為CASA）。研究表明，如果男性精液中質量差的精子所占比例超過一定范圍，意味著自然受孕的概率低，需借助輔助生殖技術進行生育。自1978年最早的輔助生殖技術（俗稱第一代試管嬰兒）誕生以來，已幫助無數的不孕不育夫婦獲得自己的小孩。隨著技術的進步和發展，胞漿內精子注射技術（ICSI，俗稱第二代試管嬰兒），因其適應于少、弱精子癥患者，且有較高的受精率，成為目前輔助生殖領域的主要關鍵技術之一。ICSI?的成功率很大程度上受精子質量準備和顯微操作技術的影響。其中如何優選成熟的、質量合格的具有受精潛能的活動精子成為關鍵的問題。現階段的操作，醫生主要憑靠個人經驗，挑選形態正常和活力強的精子，再利用顯微操縱將精子注入到成熟的卵母細胞，完成受精。因而優質精子的選取主要取決于醫生的操作經驗和判斷，主觀性強。研究表明，不育（或低生育能力）男性精液分選出的形態完全正常的精子細胞中，頭部DNA?損傷的精子占據很大比例，一旦這些形態正常但DNA?受損的精子細胞被挑選注入到卵母細胞后，將可能導致無法受精，或降低受精卵著床，影響胚胎的正常發育。更有甚者，受損DNA?遺傳到下一代，影響下一代的生育能力。

臨床?ICSI?操作前，通常將精液進行優化和預處理。如精子密度梯度離心；精子上游法；透明質酸受體檢測；凋亡精子細胞磁珠分離；以及根據精子細胞大小和所帶電荷采用的電泳分離法。盡管這些方法可篩選出形態和活動力俱佳的精子，并有效降低不成熟或可能“凋亡”精子細胞的數量，卻無法將DNA?有損傷的精子細胞完全篩除。而目前常用的精子DNA?完整性評估方法，如精子染色質結構分析試驗（SCSA），彗星試驗（COMET?assay），末端轉移酶介導的dUTP?末端標記法，染色質擴散試驗（SCD）等，無一例外的需要進行染色預處理，無法對活動精子的DNA?完整性進行評估。因此，即便檢測為正常的精子也因染色操作后無法用于卵細胞的受精。

近期，Gianaroli?等評估通過采用偏振光研究精子頭部雙折射現象評估精子細胞頂體狀態與ICSI?結果的相關性，然而頂體正常并不意味著DNA?也正常。Huser等初步開展了基于拉曼光譜的DNA?正常分裝和異常的離體精子細胞，初步驗證拉曼光譜可用于DNA?正常和受損兩種狀態區分。Victoria?等在生殖領域核心期刊Fertility?and?Sterility?首次報導了將精子頭部拉曼光譜測量結果與流式細胞儀分析精子DNA?損傷情況進行比較，發現拉曼光譜峰位1055cm^-1與1095cm^-1的比值與流式細胞儀分析的DNA碎片指數（DFI）呈線性關系，即比值越大，DNA?損傷越嚴重。然而，目前研究尚未見單個活動精子的顯微拉曼光譜研究。因而開展基于顯微拉曼的非標記的活動精子研究對于今后輔助生殖技術中精子質量的客觀評估和優質精子的篩選具有十分重要的意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種活動精子DNA的拉曼光譜快速測量方法，即首先使活動精子頭部吸附于光滑的金屬板面上，并保持原有的活力，然后采用顯微拉曼光譜技術測量精子頭部拉曼光譜數據。利用該快速測量方法得到的活動精子DNA拉曼光譜數據，與離體失活精子DNA的主要拉曼光譜數據進行比較，實現客觀評價優質精子細胞的目的，有效克服目前ICSI輔助生殖技術中主觀選擇精子存在的DNA損傷的風險。

為實現本發明的目的采用的技術方案是：

（1）精液液化

無菌試管收集精液樣品，室溫環境下靜置20分鐘使精液自然液化。

（2）精液中活動精子的分離與準備。

利用移液槍吸取已液化精液，加入到含有密度梯度離心液（Puresperm?40/80）的離心管中，1000g離心10分鐘，吸棄上層精漿，保留離心管底部的精子。而后再加入PBS緩沖液（磷酸鹽緩沖液，Phosphate?Buffer?solution）重懸，再次離心洗滌，吸棄上清，然后加入1ml?PBS緩沖液重懸制成精子懸液，置于孵育箱中孵育。

上述步驟中，液化精液：密度梯度離心液：PBS緩沖液=?2ml：1.5ml：5ml；