[發(fā)明專(zhuān)利]一種用于預(yù)測(cè)NSCLC病人預(yù)后的試劑盒及骨橋蛋白作為特異標(biāo)記物的應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410182829.8
• 申請(qǐng)日: 2014-04-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103926408A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-07-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫冰生
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/577
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/577;G01N21/64
• 代理公司: 天津市三利專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 12107
• 代理人: 張東浩

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種用于預(yù)測(cè)NSCLC病人預(yù)后的試劑盒及骨橋蛋白作為特異標(biāo)記物的應(yīng)用。

背景技術(shù)

肺癌是目前發(fā)病率和死亡率均居第一位的惡性腫瘤。盡管近幾年來(lái)肺癌的綜合治療取得很大進(jìn)展，然而其5年生存率仍然徘徊在15％左右。肺癌的70％～80％為非小細(xì)胞肺癌(Non-Small?Cell?Lung?Cancer,NSCLC)，NSCLC很容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(腦、骨、腎上腺和肝臟轉(zhuǎn)移)。即使I期肺癌患者，在術(shù)后也有27％-55％的患者將出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的情況。如何早期鑒別這部分高危人群并及時(shí)給予輔助治療是目前研究的焦點(diǎn)。

目前，包括微小RNA、基因、染色體、和蛋白等用于預(yù)測(cè)預(yù)后或干預(yù)治療的因素已被廣泛研究，其主要研究對(duì)象局限于腫瘤細(xì)胞本身，忽略了腫瘤生存的“土壤”—微環(huán)境。腫瘤的微環(huán)境指腫瘤細(xì)胞周?chē)睦w維原細(xì)胞、免疫細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)等；微環(huán)境是腫瘤與宿主之間的相互作用的直接接觸面，它在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生演進(jìn)過(guò)程中起重要作用。在腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞中最重要的是巨噬細(xì)胞。浸潤(rùn)腫瘤間質(zhì)中的巨噬細(xì)胞稱(chēng)之為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated?macrophages,TAMs)。既往認(rèn)為T(mén)AMs只是腫瘤免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中的一種重要細(xì)胞群,可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞,或者通過(guò)呈遞腫瘤相關(guān)抗原誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答從而清除腫瘤。

近年來(lái),Mantovani等提出了著名的“巨噬細(xì)胞平衡假說(shuō)”,認(rèn)為T(mén)AMs具有殺傷腫瘤和促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的雙重作用。一部分TAMs表現(xiàn)出促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的M2表型；相反另外一種表型為M1，具有抑制腫瘤的功能。NSCLC間質(zhì)中的TAMs功能尚存爭(zhēng)論，不同學(xué)者的研究結(jié)果甚至相互矛盾，目前并無(wú)確切的解釋,其關(guān)鍵因素在于目前關(guān)于M2和M1巨噬細(xì)胞缺乏特異性的標(biāo)記物。

申請(qǐng)人在研究肺癌標(biāo)本癌巢骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，不僅腫瘤細(xì)胞表達(dá)OPN，而且部分病例的腫瘤間質(zhì)中浸潤(rùn)的TAMs也表達(dá)OPN。進(jìn)一步分析顯示伴有OPN陽(yáng)性TAMs浸潤(rùn)的患者較OPN陰性TAMs浸潤(rùn)患者更容易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后更差。這在既往有關(guān)NSCLC的研究中從未報(bào)道過(guò)。

目前市場(chǎng)上銷(xiāo)售的唑來(lái)膦酸等治療惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移的藥物其機(jī)理都是通過(guò)抑制骨組織的破骨細(xì)胞(巨噬細(xì)胞分化而成)達(dá)到治療作用。大量的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)唑來(lái)膦酸可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，然而這種抑制并非“靶向”，同時(shí)包括了M1型和M2型的巨噬細(xì)胞，如果指導(dǎo)唑來(lái)膦酸的“靶向”抑制M1型將大大促進(jìn)促進(jìn)腫瘤治療的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)缺陷，而提供一種鑒別M2型TAMs的標(biāo)記物，并用于構(gòu)建預(yù)測(cè)NSCLC病人預(yù)后及指導(dǎo)唑來(lái)膦酸臨床應(yīng)用的試劑盒。

本發(fā)明的另外一個(gè)目的在于提供一種將骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)作為M2型巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記物的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的所采用的技術(shù)方案是：一種用于預(yù)測(cè)NSCLC病人預(yù)后的試劑盒，其特征在于包括CD68單克隆抗體、OPN單克隆抗體、熒光二抗和免疫熒光試劑。

所述熒光二抗為CD163標(biāo)記M2鼠抗人單克隆抗體和MHCII標(biāo)記M1鼠抗人單克隆抗體。

免疫熒光試劑包括pH為7.2-7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS，全稱(chēng)Phosphate?Buffered?Saline)、0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖液、3％的牛血清白蛋白和熒光淬滅抑制劑。

所述磷酸鹽緩沖液是將8.00g的NaCl、0.20g的KCl、2.083g的Na₂HPO4·12H₂O、0.261g的KH₂PO4·12H₂O放入950ml的蒸餾水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.2-7.4，然后蒸餾水定容至1000ml制備而成。

所述檸檬酸鈉緩沖液是將3g的檸檬酸三鈉、0.4g的檸檬酸加入1000ml的蒸餾水制備而成。

上述骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)可作為M2型巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記物的應(yīng)用。

本發(fā)明的原理及有益效果是：本發(fā)明能夠體現(xiàn)OPN陽(yáng)性表達(dá)的TAMs是一預(yù)后預(yù)測(cè)標(biāo)記物，可作為非小細(xì)胞肺癌移復(fù)發(fā)、預(yù)后預(yù)測(cè)提供新的試劑盒，通過(guò)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)OPN陽(yáng)性TAMs可作為唑來(lái)膦酸抗腫瘤治療療效的標(biāo)記物；應(yīng)用本發(fā)明試劑盒是采用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測(cè)組織芯片中OPN在TAMs和腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，對(duì)NSCLC病人預(yù)后進(jìn)行評(píng)估，并針對(duì)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果及時(shí)采取綜合手段干預(yù)，提高病人遠(yuǎn)期生存率，改善預(yù)后，方法簡(jiǎn)單、方便、可廣泛應(yīng)用于臨床。