[發明專利]從楊樹菇中分離的具有免疫佐劑作用的蛋白提取物及其提取方法和應用在審

申請號：	201410181698.1	申請日：	2014-04-30
公開（公告）號：	CN103923165A	公開（公告）日：	2014-07-16
發明（設計）人：	馬立保;孫慧;黃敏;張金林;胡曉芬;吳艷麗;吳曉明	申請（專利權）人：	武漢華揚動物藥業有限責任公司
主分類號：	C07K1/30	分類號：	C07K1/30;C07K1/22;C07K1/16;C07K14/375;C12N15/31;A61K39/39
代理公司：	北京康思博達知識產權代理事務所(普通合伙) 11426	代理人：	余光軍
地址：	430205 湖北省武漢市東***	國省代碼：	湖北;42
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摘要：
搜索關鍵詞：	楊樹分離具有免疫佐劑作用蛋白提取物及其提取方法應用
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及從真菌中分離提取的蛋白提取物及其用途，尤其涉及從楊樹菇(Agrocybe?aegerita)中分離得到的蛋白提取物、從這種蛋白提取物中分離得到的蛋白亞組分以及進一步從其中分離純化得到的凝集素AAL，本發明還涉及它們的分離純化方法及其作為疫苗免疫佐劑的應用，屬于楊樹菇活性成分的分離和應用領域。

背景技術

人口密度的不斷增加、交通的發達，帶來了越來越多的疾病的爆發和傳染，例如：新病毒、SRARS、H5N1等?？刂萍膊”l的最有效手段是疫苗，但是，目前，大多數疫苗都存在保護率低或者安全性不高的問題。為疫苗尋找高效的佐劑，則可以改善疫苗目前存在的這些問題。

鋁鹽是唯一被美國批準用于人用和獸用的疫苗。在歐洲，M59和virosome于1997年分別批準用于Fluad和Inflexal?V流感疫苗，AS04于2005年批準用于HBV疫苗，2007年批準用于HPV疫苗，AS03于2008批準用于Prepandrix流感疫苗。目前，有佐劑效果的佐劑很多，但獲批的佐劑卻很少，因此，需要尋找更多安全高效的佐劑用于篩選可用于臨床的佐劑。

中草藥的使用有著千余年的歷史，因其獨特的藥用價值、安全性、價格優勢贏得了越來越多科學研究者的親睞。研究發現很多中草藥具有調節免疫的作用，分離得到的活性成分主要有：多糖類、苷類、生物堿類。近年來，關于這些活性成分的佐劑效果的研究也越來越多，多糖的毒性和副作用小的同時免疫調節活性也低，生物堿的副作用比較強，皂苷是目前比較成功的中草藥來源的佐劑，但其具有較高的凝血活性限制了其作為佐劑的應用。因此，高效安全的中草藥來源的佐劑有待進一步的發掘與應用。

藥用真菌楊樹菇(Agrocybe?aegerita)，又名柱狀田頭菇、楊樹菇、柳松茸等，隸屬于真菌門、擔子菌綱、傘菌目、糞銹傘科、田蘑屬。在亞洲和歐洲，楊樹菇已經成為特別受人們歡迎的功能食品。楊樹菇中蛋白含量高達干物質的20％-30％，富含人體必需的八種氨基酸，其中賴氨酸高達1.75％，其營養價值超過香菇、金針菇等其它食用菌，民間常將其用于抗癌、降血壓，治療胃冷、腎炎、水腫等，其蛋白組分是主要的抗腫瘤活性成分。迄今為止，尚未有從楊樹菇(Agrocybe?aegerita)中分離的蛋白成分具有免疫佐劑功效的報道。

發明內容

本發明的目的之一是提供一類從楊樹菇中提取分離的具有免疫佐劑作用或提高機體免疫力功效的總蛋白混合物；

本發明的目的之二是從所分離的楊樹菇總蛋白混合物中進一步分離得到具有免疫佐劑作用或提高機體免疫力功效的蛋白亞組分；

本發明的目的之三是從楊樹菇的總蛋白混合物中分離得到具有免疫佐劑作用或提高機體免疫力功效的凝集素AAL；

本發明的目的之四是將所提取分離的楊樹菇總蛋白混合物、蛋白亞組分以及凝集素AAL應用于疫苗的免疫佐劑以提高疫苗的防治效果。

本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的：

一種從楊樹菇中提取分離的具有免疫佐劑作用或提高機體免疫力功效的總蛋白混合物，該總蛋白混合物通過以下方法制備得到：

(1)將楊樹菇粉碎后用水或磷酸鹽緩沖液浸泡抽提，得到抽提液；

(2)將步驟(1)所得到抽提液用分段硫酸銨鹽析法進行沉淀；

(3)將沉淀用水或磷酸鹽緩沖液重懸后，透析、干燥，即得。

為了達到更好的技術效果，優選的，步驟(1)將楊樹菇子實體烘干粉碎后用水或緩沖液浸泡抽提2-3次；

優選的，步驟(2)中將抽提液過濾，將濾液用硫酸銨進行沉淀；其中，所述的分段硫酸銨鹽析法優選為：首先向濾液中加入硫酸銨至0.1-40％飽和度，攪拌、離心，棄沉淀，取上清；向上清中加入硫酸銨至41-80％飽和度，離心，取沉淀。