[發明專利]酵母重組表達門冬胰島素的制備方法

有效

• 申請號: 201410181346.6
• 申請日: 2014-05-04
• 公開（公告）號: CN105087724B
• 公開（公告）日: 2019-12-03
• 發明（設計）人: 馮一建;范開;何勇
• 申請（專利權）人: 重慶派金生物科技有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K14/62;C12P21/06;C12R1/84;C12R1/865
• 代理公司: 50213 重慶中之信知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 張景根<國際申請>=<國際公布>=<進入

酵母重組表達門冬胰島素的制備方法。本發明公開了一種畢赤酵母重組表達門冬胰島素的制備方法。具體包括在酵母中高效分泌表達重組人門冬胰島素原、賴氨酰內肽酶單一酶切獲得缺失B30的門冬胰島素、偶聯蘇氨酸酯、脫保護、反相純化及結晶的工藝過程。本發明方法更適合重組門冬胰島素工業化制備。

技術領域

本發明屬于生物技術下重組蛋白的制備領域。本發明公開了由酵母重組表達門冬胰島素的制備方法。

背景技術

糖尿病是胰島素分泌缺陷或胰島素抵抗導致的以高血糖為特征的代謝紊亂病癥。目前，中國已成為世界上糖尿病患者人數最多的國家。糖尿病已成為僅次于心腦血管疾病和腫瘤的第三大危害性疾病。糖尿病患者常常伴有多種并發癥，容易導致腎臟、眼、心臟和血管等眾多器官損害、功能性障礙和衰竭，危害性極大。

由于飯后葡萄糖的峰值與注射胰島素的峰值到達時間的偏離，給胰島素注射液的應用帶來困難，從而推動了單體胰島素類似物的產生。上世紀末，人們開發出了速效胰島素—重組門冬胰島素，是將人胰島素B鏈B28位脯氨酸（Pro）突變為天門冬氨酸（Asp）。此改變，破壞了兩個胰島素單體分子在形成二聚體時重要的范德華力，使其不易形成二聚體。重組門冬胰島素制劑注射后，其藥代動力學接近人胰島素的生理分泌曲線。與常規人胰島素相比，其藥代動力學特性是常規人胰島素的一半左右，起效時間為10~20分鐘，達到峰值時間為40分鐘，作用持續時間3~5小時，既有效控制了血糖，也不會造成夜間嚴重的低血糖事件。

在中國專利CN98813941.3 中，公開了一種制備重組胰島素類似物的方法，該方法在獲得正確構象的胰島素原后，先用胰蛋白酶酶切，形成具有正確構象的Arg(B31)-胰島素，純化后再用羧肽酶B 去除Arg(B31)-胰島素C端的Arg，形成正確構象的胰島素，最后再用HPLC 純化。

在中國專利CN103305581A中，公開了一種制備重組胰島素的方法，該方法中通過用胰蛋白酶酶切，然后偶聯B30的蘇氨酸，最后得到普通胰島素。但其方法不適合門冬胰島素的制備，因胰蛋白酶無法酶切B28-29為Asp-Lys的Lys的羧基端肽鍵。

在中國專利CN102159588A 中，公開了一種制備門冬胰島素的方法，該方法中通過構建含有B30蘇氨酸的門冬胰島素原，然后胰蛋白酶和羧肽酶B同時酶切門冬胰島素原的方法，獲得門冬胰島素。該方法的得率低于70%，且酶用量偏高。

在中國專利CN1589328A 中，公開了一種制備門冬胰島素的方法，該方法中通過選用無色桿菌蛋白酶Ⅰ酶切，酶切完成后直接改變條件轉肽，偶聯蘇氨酸酯。

本發明專利中公開了重組門冬胰島素的制備方法。該方法通過巴斯德畢赤酵母分泌表達含有三對二硫鍵正確構象的門冬胰島素原后，用賴氨酰內肽酶高效單一酶切，得到缺失B30位的門冬胰島素，然后在賴氨酰內肽酶作用下偶聯叔丁醚蘇氨酸叔丁酯（蘇氨酸酯）；再脫去保護基團，經反相精純化和結晶，得到重組門冬胰島素。本發明工藝中，酶切、偶聯效率高，且偶聯后相關物質的反相色譜中行為差異顯著，易于精純化，更適合工業化制備重組門冬胰島素。

發明內容

本發明提供了重組門冬胰島素新的表達途徑，以及重組門冬胰島素原單一酶切和偶聯方法，從而提高重組門冬胰島素的工藝水平和生產能力。

本發明中，重組門冬胰島素制備工藝具體包括以下步驟：

）通過酵母發酵獲得正確構象的門冬胰島素原；

）金屬螯合層析和陽離子交換層析純化門冬胰島素原；

）選用賴氨酰內肽酶酶切門冬胰島素原，獲得缺失B30位的門冬胰島素；

）B30位偶聯蘇氨酸酯；

）反相純化步驟樣品；

）步驟樣品的脫保護及反相精純化；

）結晶步驟樣品。