[發明專利]一種基因工程惡臭假單胞菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201410180577.5
• 申請日: 2014-04-30
• 公開（公告）號: CN103952429B
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發明（設計）人: 許平;于浩;唐鴻志;馬翠卿
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/78
• 分類號: C12N15/78;C12N1/21;C12P17/12;C12R1/40
• 代理公司: 上海旭誠知識產權代理有限公司31220
• 代理人: 鄭立

1.一種用于6-羥基-3-琥珀酰吡啶生產的基因工程惡臭假單胞菌的構建方法，

其特征在于，包括以下步驟：

(1)利用PCR技術，以惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN(保藏編號為CCTCC No.M 205038)基因組為模板，擴增得到命名為hspB的6-羥基-3-琥珀酰吡啶3-羥化酶基因的部分基因片段；

(2)利用內切酶分別對步驟(1)中得到的基因片段和pK18mob質粒進行雙酶切，所述雙酶切使用EcoRI和BamHI；

(3)將步驟(2)中雙酶切后的所述基因片段和所述pK18mob質粒用連接酶進行連接，構建敲除用重組質粒pK18mob-hspB；

(4)將步驟(3)中得到的所述敲除用重組質粒pK18mob-hspB轉化入大腸桿菌S17-1中，作為雙親雜交的供體菌株；

(5)選用惡臭假單胞菌XPSN作為受體菌株培養，將其與步驟(4)中得到的供體菌株進行雙親雜交，經過篩選和驗證后獲得基因工程惡臭假單胞菌，命名為P-HSP，

其中，所述步驟(1)中所述擴增使用上游引物PH-F：

5′-ccggaattcggggacaaatgtggtggtg-3′，下游引物PH-R

5′-cgcggaatcccaagaactacccgaacaga-3′；所述步驟(5)中的驗證為PCR擴增驗證，使用的引物為：上游引物為mob-F：5′-cggctcgtataatgtgtgga-3′，下游引物為hspB-R 5′-ctacagaaaggtttccatagt-3′。

2.一種根據權利要求1所述的構建方法構建的基因工程惡臭假單胞菌P-HSP，保藏編號為CCTCC M 2014135，保藏于中國典型培養物保藏中心。

3.一種利用基因工程惡臭假單胞菌P-HSP生產6-羥基-3-琥珀酰吡啶的方法，其特征在于以尼古丁為底物，以基因工程惡臭假單胞菌P-HSP為生物催化劑，包括以下步驟：

(1)斜面培養：將所述基因工程惡臭假單胞菌P-HSP接種到固體培養基斜面上，28-32℃培養11-13小時；

(2)種子培養：將步驟(1)培養的菌株，接種到含有卡那霉素的液體培養基中，于28-32℃培養10小時，制得種子；

(3)制備休止細胞：將步驟(2)中得到的所述種子接種到同時含有卡那霉素和尼古丁的液體培養基中，28-32℃培養9-11小時，然后離心，收集菌體，并用0.9％NaCl洗滌一次，再用蒸餾水重懸菌體沉淀，即為惡臭假單胞菌P-HSP休止細胞，4℃儲存備用；

(4)轉化反應：在所述惡臭假單胞菌P-HSP休止細胞中加入尼古丁，調節pH至9.0，在28-32℃、110-130轉/分鐘的條件下振蕩反應，然后終止轉化反應，所述惡臭假單胞菌菌株P-HSP休止細胞能用于分批反應，或用于補料分批連續轉化反應；

(5)生物催化劑的分離：將步驟(4)終止轉化反應后的混合液離心，分離沉淀，即得到含有6-羥基-3-琥珀酰吡啶的上清液；

(6)樣品濃縮：將步驟(5)中分離得到所述上清液進行蒸餾，制得濃縮液；

(7)6-羥基-3-琥珀酰吡啶的提取：將步驟(6)中制得的所述濃縮液用鹽酸調節pH至2.5以下，室溫靜置1.5-2.5小時，使6-羥基-3-琥珀酰吡啶充分沉淀，然后去除上清，再用鹽酸溶液洗滌得到的沉淀，最后干燥所述沉淀，得到的粉末即為6-羥基-3-琥珀酰吡啶，

其中，所述生物催化劑重復使用，將所述步驟(5)中的所述沉淀用蒸餾水重懸，重新制得基因工程惡臭假單胞菌P-HSP的休止細胞，并重復步驟(4)至(5)；所述重復為一次或兩次，第一次重復時，加入的尼古丁的終濃度為4g/L，反應時間為5小時，第二次重復時，加入的尼古丁終濃度為4g/L，反應時間為6小時。

4.根據權利要求3所述的生產6-羥基-3-琥珀酰吡啶的方法，其特征在于所述步驟(4)中分批反應時加入尼古丁的初始濃度為6g/L，反應時間為5小時。

5.根據權利要求3所述的生產6-羥基-3-琥珀酰吡啶的方法，其特征在于所述步驟(4)中補料分批連續轉化反應中先加入尼古丁的初始濃度為6g/L，然后分別在轉化開始后5小時、10小時和17小時補充終濃度為4g/L的尼古丁，23小時后終止轉化反應。