[發明專利]一種檢測溶液中MMP9蛋白的方法

有效

• 申請號: 201410180514.X
• 申請日: 2014-04-30
• 公開（公告）號: CN103940784A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發明（設計）人: 王志平;劉映前;姚小軍;王靜;張麗秀;祁萍
• 申請（專利權）人: 蘭州大學
• 主分類號: G01N21/552
• 分類號: G01N21/552
• 代理公司: 蘭州中科華西專利代理有限公司 62002
• 代理人: 李艷華

技術領域

本發明涉及化學醫藥領域，尤其涉及一種檢測溶液中MMP9蛋白的方法。

背景技術

分子對接技術（Molecular?docking?technology）從分子水平上模擬生物大分子特異性的活性中心與配體小分子之間的相互作用，計算出大分子和小分子之間的結合自由能，用于設計新的能和大分子物質特異性結合的、親和性強的配體小分子，可節省大量時間，縮短實驗過程分子。對接技術是計算機輔助藥物設計中常用的一種方法和手段，近年來在藥物設計方面取得了很大的成功，分子對接技術的引入成為解決特定蛋白的特異性識別的一種可能。

合成化學是有機化學、無機化學、藥物化學、高分子化學、材料化學等學科的基礎和核心。合成化學提供了很多藥物生產的新途徑，合成了磺胺類、抗生素類、維生素類以及口服避孕藥等。現在很多鎮痛劑、麻醉劑、防腐劑、催眠劑等都是合成出來的。合成化學與生物學、物理學等學科的密切配合，預計將來在征服疾病如癌癥、精神病，以及控制遺傳，延長人類的壽命等方面會發揮重要作用。

表面等離子體共振(?surface?plasmon?resonance,?SPR)?技術利用全反射時入射光可以和金屬表面的等離子發生共振的原理，探測生物分子之間是否發生作用以及反應的動力學參數，是發生在光學介質界面（SPR芯片）上的非常靈敏的光學現象。SPR技術由瑞典科學家Liedberg?等于80?年代首次運用于IgG抗體與其抗原相互反應的測定。隨后，該技術被引入生物傳感器領域并迅速滲透到基礎生命科學研究中。基于SPR?技術的光學生物傳感器具有其它相互作用技術所無法比擬的優點：如高靈敏度（無需逐級放大試驗，檢測靈敏度就可達到pg水平），不需對分子進行標記、能實時檢測生物分子結合反應的全過程等，其發展非常迅速，已經成為一種成熟的檢測生物分子間相互作用的方法。研究發現SPR較ELISA方法相比有著無需逐級放大反應即可達到相似的檢測敏感度（ng/ml），且無需標記，步驟簡單的特點，從而達到對所檢測微量蛋白質的無需標記、無需逐級放大反應的直接檢測。SPR?生物傳感器目前在生物分子相互作用、藥物篩選、食物檢測及環境監控等領域廣泛應用。

近年來由于分子對接技術在大分子物質的特異性識別優勢，在藥物靶標設計等方面獲得了廣泛應用，并取得了良好的成績；但基于用分子對接原理設計的小分子配體在SPR芯片表面檢測特異性蛋白方面的研究上尚未見報道。因此尋找一種新的基于分子對接技術、合成化學和SPR技術相結合的方法對溶液中特異性蛋白進行檢測不僅具有創新性，更具有重要的科研價值。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種高靈敏度的檢測溶液中MMP9蛋白的方法。

為解決上述問題，本發明所述的一種檢測溶液中MMP9蛋白的方法，包括以下步驟：

⑴應用分子對接技術設計MMP9的特異性小分子配體，該MMP9的特異性小分子配體的化學結構式如下：

；

⑵小分子配體的化學合成：

①制備氟化鉀-氟化鈣（KF-CaF₂）熔融物：

將二水氟化鉀和氟化鈣按物質的量之比為1：1.5~2.5混合，攪拌均勻后研磨1~2h，得到粉末狀混合物，該粉末狀混合物在140~160℃下真空干燥5~8h，即得氟化鉀-氟化鈣（KF-CaF₂）熔融物；

②在干燥乙腈中依次加入對甲基苯磺酰氯、所述氟化鉀-氟化鈣熔融物，常溫下攪拌8~12h，反應結束后用沙芯漏斗覆蓋2~3cm厚的硅藻土進行過濾，得到濾液，該濾液經30~40℃減壓蒸餾，得到白色固體對甲基苯磺酰氟；所述對甲基苯磺酰氯與所述干燥乙腈的質量體積比為5g：30~40mL；所述對甲基苯磺酰氯與所述氟化鉀-氟化鈣熔融物的質量比為5g：6~8g；