[發明專利]一種提取純化M-MLV逆轉錄酶的方法

在審

• 申請號: 201410180381.6
• 申請日: 2014-04-30
• 公開（公告）號: CN104250642A
• 公開（公告）日: 2014-12-31
• 發明（設計）人: 魏劭;林家旺;魏超
• 申請（專利權）人: 廈門安普利生物工程有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12R1/19
• 代理公司: 廈門市精誠新創知識產權代理有限公司 35218
• 代理人: 方惠春

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種提取純化M-MLV逆轉錄酶的方法。

背景技術

Moloney?Murine?Leukemia?Virus?Reverse?Transcriptase（M-MLV?RT，M-MLV逆轉錄酶）是一種RNA依賴的DNA聚合酶，基因來源是莫洛尼(氏)鼠白血病病毒基因組。它可以以單鏈RNA、DNA或RNA-DNA雜交體為模板進行cDNA合成。

M-MLV逆轉錄酶是從原核表達菌中（含M-MLV?Reverse?Transcriptase基因的BL21(DE₃)工程菌）進行提取純化。

目前，因活性蛋白容易變性失活因而純化都是要求在低溫條件下進行（冰上操作），常規純化M-MLV逆轉錄酶方法采用低溫超聲破碎，反復通過硫酸銨沉淀、離子交換、層析和脫鹽進行純化，不僅高達50%的蛋白會在純化初期就會損失，而且部分基因組蛋白很難完全去除，再加上基因組蛋白的存在會導致上柱速度緩慢，延長純化時間，純化得到的蛋白酶活降低，影響了后期酶的逆轉錄活性。

發明內容

本發明的目的在于提供一種簡單，酶活性損失小，回收蛋白的純度和回收量高的活性蛋白酶的提取方法。

為實現上述目的，本發明提供一種提取純化M-MLV逆轉錄酶的方法，其特征在于，包括如下步驟，

1）工程菌的活化和表達：取M-MLV逆轉錄酶工程菌進行活化后并振蕩培養后加入IPTG誘導；洗滌；離心收集菌體；收集的菌體用緩沖液A洗滌，離心；再用緩沖液A重懸得到表達的工程菌；

2）粗蛋白制備：將所述表達的工程菌用溶菌酶室溫處理后加入DTT，吐溫-20，冰上處理一段時間后離心，得到的上清即為粗蛋白；

3）粗蛋白中緩慢加入二氧化硅顆粒，磁力攪拌器上攪拌，離心去除沉淀得到上清；

4）將所述得到的上清移至已經預熱至60℃的水浴鍋中，孵育后離心，去除沉淀，得到上清；

5）上清流過已螯合Ni2+的Ni-NTA柱，再進行脫鹽得到純化的M-MLV逆轉錄酶；

所述緩沖液A為20mM?Tris-HCl，0.2M?NaCl，pH?8.0；?

任選的，得到的M-MLV逆轉錄酶加入甘油使體積分數為50%，-20℃保存。

所述M-MLV逆轉錄酶工程菌為從莫洛尼氏鼠白血病病毒中PCR擴增得到PCR產物，所得PCR產物經SalⅠ、HindIII雙酶切后連接至經SalⅠ、HindIII雙酶切的PET28a載體上，構建表達載體PET28a-M-MLV，將上述質粒轉化表達菌BL21(DE₃)，即獲得生產重組M-MLV逆轉錄酶的工程菌株。

所述PCR擴增所用的引物為SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2。

所述步驟1）為取M-MLV逆轉錄酶工程菌接種到含卡那霉素的LB液體培養基中，振蕩培養；取活化好的菌液轉接到同樣的LB液體培養基中，振蕩培養后加入IPTG誘導培養8小時；用離心管超聲洗滌30min，并用雙蒸水潤洗一次；離心收集菌體；收集的菌體用緩沖液A洗滌，離心；再用緩沖液A重懸得到表達的工程菌。

所述步驟1）為取M-MLV逆轉錄酶工程菌接種到含卡那霉素的LB液體培養基中，37℃，200rpm振蕩培養過夜；取活化好的菌液轉接到同樣的LB液體培養基中，37℃，250?轉/分振蕩培養4小時后加入1M?IPTG至終濃度1.0mmol/L，28℃、250?rpm件下培養8小時；用離心管超聲洗滌30min，并用雙蒸水潤洗一次；12000rpm，4℃離心5分鐘收集菌體；收集的菌體用緩沖液A洗滌一次，12000rpm，4℃離心5分鐘；再用緩沖液A重懸得到表達的工程菌。

所述步驟2）為將所述表達的工程菌用4mg/ml終濃度溶菌酶室溫處理20分鐘后加入DTT使終濃度為1mM，加入吐溫-20使體積百分比為0.5%，冰上處理45分鐘，15000g/4℃/20分鐘，得到的上清即為粗蛋白。

所述步驟3）為粗蛋白中緩慢加入體積系數5%的二氧化硅顆粒，磁力攪拌器上攪拌10分鐘，15000g，4℃離心20分鐘，去除沉淀。

所述步驟4）中孵育10分鐘，離心條件為15000g/4℃/20分鐘。